核酸分子杂交ppt课件

核酸分子杂交
一、概念：
1、分子杂交（hybridizat子浓度等条件下，通过碱基 互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体 支持物上的过程。
3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物 素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特 异性互补的已知DNA或RNA片段。
(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。 被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
二、Southern杂交
1、步骤：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后 的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下 列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。
进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到 一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一 张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂 解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
五、斑点杂交
（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。
后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正 电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获 得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可 促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形 成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价 结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
三、Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别 是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去 除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将 RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非 特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素， 包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比 活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的 配对情况等。在最佳条件下，放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的 高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基 因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探 针杂交，曝光过夜，则可检测出哺乳动物基因组中1kb 大小的单拷贝序列。
4、种类：
固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA 固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与 探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
液相杂交（solution hbridization）指使变性的待测核酸 单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形 成杂交复合物。
注意：
（1）RNA对碱性敏感，不能用NaOH溶液作为转膜夜。 如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或 待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L NaOH浸泡凝 胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经 DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分 钟。然后再转移到滤膜上。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern发明，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时， 才采用电泳转移。
（2）含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处 理的水淋洗数次,以除去甲醛。
（3）尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时 尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中, 会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂 交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。
四、菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交
RNA与RNA杂交
5、几种常见的杂交：
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支 持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂 交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。 根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
(1) Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝 胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针 杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是 将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，
再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼 脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的 杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会 使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移 要高。
4、毛细管转移法转膜用的溶液：
（1）高盐溶液：1.5M NaCl
（2）0.4N NaOH
如果DNA分子大，可以用0.25N HCL处理或用紫外线处 理，将DNA分子适当打断，以提高转移的效果，注意处 理的时间适度！！
5、转膜后DNA的固定方式：
转膜后，膜用2×SSC漂洗，然后固定：
（1）80℃干烤0.5-2小时；