细胞生物学技术课件细胞转染与传代
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细胞转染PPT课件
蛋白转染
Adherent cell lines
3T3 L1 A549 BHK-21 CaSki CHO CV-1 HEK-293
60-80% 80% 30-40% 80-90% 80-90% 50% 45-55%
HeLa HepaRG MCF-7 MLE-15 NIH-3T3 RAW 264.7 Si Ha
• Release
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技术原理
蛋白转染
PULSin™: cationic amphiphilic-based formulation
第12页/共73页
操作步骤
蛋白转染
For 24-well plate:
细胞融合度：70-80%
1 稀释蛋白：1µg of protein/100µl Hepes 2 加 4 µl PULSin™ 3 孵育 15 min
第3页/共73页
-
-
-
细胞转染难易比较
体外转染
Adherent > Suspension
Problem: Membrane
E.g.:
THP1, Jurkat…
Fast dividing cell > non dividing cell
Problem: Access to the nucleus
E.g.:
k562gapdh788thp1gapdh818sirna转染转染第32页共73页原代细胞的高效沉默24wellplatebrancheddnaassay20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm96人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82sirna转染转染第33页共73页interferin优势低浓度sirna甚至pmol级别就能达到高效的基因沉默在反向操作转染中的效率高sirna转染转染第34页共73页sirna转染竞争对手lipofectamine2000invitrogenolgofectamineinvitrogenhiperfectqiagensilentfectbioradlargestsirnatransfectionmarketdangerousoutsiderhiperfectsirna转染转染第35页共73页nterferinvslipofectamine2000interferinlipofectamine2000sirna浓度nmsirna降低成本20100nmsirna40nm血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul1050pmol0515ul价格第36页共73页nterferinvsoligofectamineinterferinoligofectaminesirna浓度nmsirna100nmsirna血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上一般操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul60pmol3ul价格第37页共73页nterferinvshiperfectsilentfectinterferinhiperfectsilentfectsirna浓度nmsirna5nmsirna10nmsirna细胞融合度305050805090基因沉默效率高见表见表见表细胞毒性无细胞毒性细胞毒性较小细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol84ng13ul375ng3ul价格
细胞转染技术 PPT
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一 种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中 间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞 中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合， DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染 各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基 因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清 清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反 应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限 制。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 。G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
ห้องสมุดไป่ตู้
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都 比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中 的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因 整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合， 会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培 养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少 表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白 的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。 只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想 要的遗传稳定的细胞克隆。
细胞生物学实验PPT课件
细胞生物学实验ppt课件
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
细胞转染技术 PPT
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
细胞转染简介PPT教案
样，电泳图谱不一样。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载
体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是
不同的 。
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C. 插入法(单酶单切点)或替代法 (双酶双位点)酶切，一般来说用 3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片 段的大小,方向,切后并电泳分 析,以确定是否得到预期的olyA尾设计共同引物 → 将所用 mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA 计 算 机 克 隆 － 即 利 用 GenBank 信息，利用不同种属同源性设计 引物，尝试获取未知基因片段， 这有赖于各种计算机软件的应用。
➢ (1)基础培养基
➢ (2)胎牛血清
➢ (3)添加剂
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➢ 5 转染方案
➢ 一般原则：建立一套适当的转
染方案；首先从一种标准方案 开始，然后通过改变试剂/DNA
的配比和复合物的剂量进行优 化。
➢ （1）转染复合物的制备
➢ （2）转染试剂/DNA配比（负
载比）
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Hale Waihona Puke ➢ （3）转染复合物的加入
➢ 6 时间进度
➢ 一般原则提示：要确保最终结 果的成功；建立一个合适的时 间进度进行转染实验以保证您 所需要的目的蛋白能得到最佳 表达。
➢ （1）转染的开始 ➢ （2）培养基更第3换8页/共40页
➢ （3）时间测定
谢谢指导！
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第21页/共40页
➢ 【主要应用】:瞬时转染 稳定 转染
➢ 【特点】：使用方法简单，可 携带大片段DNA，通用于各种 类型的裸露DNA或RNA，能转 染各种类型的细胞，没有免疫 原性。虽在体外基因转染中有 很高的效率，但第22页在/共40体页 内，能被 血清清除，并在肺组织内累积，
优选细胞的培养及转染
• Sf9的分裂周期大概是27小时左右
Sf9传代的方法
• 1）吸取或者倾出旧培养液。 • 2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，
反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底 壁。 • 吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另 一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确 保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动 作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直 接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细 胞碎片增多。 • 经吹打后，得到细胞悬液。
•
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
• 简易程序：
•
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
• （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
– 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会 造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程 应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰 晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min
•
当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min
• 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
• 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
Sf9传代的方法
• 1）吸取或者倾出旧培养液。 • 2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，
反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底 壁。 • 吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另 一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确 保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动 作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直 接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细 胞碎片增多。 • 经吹打后，得到细胞悬液。
•
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
• 简易程序：
•
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
• （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
– 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会 造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程 应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰 晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min
•
当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min
• 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
• 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
02细胞生物学技术PPT课件
把一物体放在光源和观察者之间，当光线通 过一固体物的边缘时，在高倍放大情况下所观察 到的干涉效应。
15
相差显微镜和微分干涉差显微镜
用相差显微镜和微分干涉差显微镜可直接从显微中 观察未经固定和染色的活细胞。
通过活细胞的光的相位 发生了变化，相差和微分干 涉差显微镜可使光相位变化 转变为振幅变化，产生高反 差影像。
不同显微结构的尺寸
由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖 体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。
5
凸透镜的五种成象规律
物距 (u)
像距(v) 正倒
大小
虚实
u>2f 2f>v>f 倒立 缩小 实像
u=2f v=2f 倒立 等大 实像
2f>uቤተ መጻሕፍቲ ባይዱf v>2f 倒立 放大 实像
• 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、 真空系统、记录系统、电源系统等5部 分构成；
• 分辨率0.2nm，放大倍数达百万倍； • 用于观察超微结构（小于0.2µm）。
27
制样技术
超薄切片技术 固定技术 负染法和投影法 复型和冷冻蚀刻技术
28
超薄切片技术
电子的穿透能力很弱， 因此要把样品做成很薄。
2. 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。 3. 了解细胞生物学研究方法的进展。
3
细胞生物学的许多进展，尤其是近年来振奋 人心的发展，都是由于引入新研究方法的结果。
1 显微镜技术 2 细胞培养 3 细胞及其组份的分离和纯化 4 重组DNA技术 5 细胞工程技术
4
一、显微镜技术
一个典型的动物细胞，直径为10~20µm，比 人肉眼能见到的最小颗粒还小5倍。
最常用的是50纳米左右 的切片，即一个一般大 小的 动物细胞要切成300片。 用超 薄切片机 （ultramicrotome） 制作。
15
相差显微镜和微分干涉差显微镜
用相差显微镜和微分干涉差显微镜可直接从显微中 观察未经固定和染色的活细胞。
通过活细胞的光的相位 发生了变化，相差和微分干 涉差显微镜可使光相位变化 转变为振幅变化，产生高反 差影像。
不同显微结构的尺寸
由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖 体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。
5
凸透镜的五种成象规律
物距 (u)
像距(v) 正倒
大小
虚实
u>2f 2f>v>f 倒立 缩小 实像
u=2f v=2f 倒立 等大 实像
2f>uቤተ መጻሕፍቲ ባይዱf v>2f 倒立 放大 实像
• 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、 真空系统、记录系统、电源系统等5部 分构成；
• 分辨率0.2nm，放大倍数达百万倍； • 用于观察超微结构（小于0.2µm）。
27
制样技术
超薄切片技术 固定技术 负染法和投影法 复型和冷冻蚀刻技术
28
超薄切片技术
电子的穿透能力很弱， 因此要把样品做成很薄。
2. 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。 3. 了解细胞生物学研究方法的进展。
3
细胞生物学的许多进展，尤其是近年来振奋 人心的发展，都是由于引入新研究方法的结果。
1 显微镜技术 2 细胞培养 3 细胞及其组份的分离和纯化 4 重组DNA技术 5 细胞工程技术
4
一、显微镜技术
一个典型的动物细胞，直径为10~20µm，比 人肉眼能见到的最小颗粒还小5倍。
最常用的是50纳米左右 的切片，即一个一般大 小的 动物细胞要切成300片。 用超 薄切片机 （ultramicrotome） 制作。
细胞传代PPT演示课件
8
表1 清洁液配方
配方成 常用方 分
重铬酸 100 钾（g） 清水(ml) 800
浓硫酸 200 (ml) 硫酸浓 20 度(%)
弱酸 50 1000 90 8
次强酸 强酸
100
60
1000 200
160
800
14
80
9
清洁液的配制和使用注意事项 ①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。 ②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不
13
（二）塑料器皿的处理
组织培养常用的塑料器皿包括各种培 养板、培养皿及培养瓶等。这些产品 主要为进口的一次性物品，供应商提 供给用户时已消毒灭菌并密封包装， 打开包装即可使用。
一些不是无菌包装的塑料器皿，如枪 头、离心管等，只要包装消毒就可以 使用了。
14
如果要重复使用塑料器皿，可以按以下 步骤处理:
加入3mlD-Hanks轻轻晃动后去液体。 加入胰蛋白酶5滴，翻转培养瓶，使消化液浸
没细胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观 察发现细胞质回缩，胞体变圆) 加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动 作要轻柔不要用力过猛。
39
将细胞悬液移至15ml离心管中， 1500rpm*5min离心。
实验总体安排
一.细胞培养的基本技术
实验前准备
细胞传代
细胞冻存与复苏
细胞计数与接种孔板
1
二.专题 1.MTT实验 2.细胞凋亡： JC-1 检测线粒体膜电位 3.免疫荧光技术：核蛋白（PCNA)的免疫荧
光 4.流式细胞仪的应用：细胞周期的检测 5.电镜
2
实验内容
表1 清洁液配方
配方成 常用方 分
重铬酸 100 钾（g） 清水(ml) 800
浓硫酸 200 (ml) 硫酸浓 20 度(%)
弱酸 50 1000 90 8
次强酸 强酸
100
60
1000 200
160
800
14
80
9
清洁液的配制和使用注意事项 ①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。 ②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不
13
（二）塑料器皿的处理
组织培养常用的塑料器皿包括各种培 养板、培养皿及培养瓶等。这些产品 主要为进口的一次性物品，供应商提 供给用户时已消毒灭菌并密封包装， 打开包装即可使用。
一些不是无菌包装的塑料器皿，如枪 头、离心管等，只要包装消毒就可以 使用了。
14
如果要重复使用塑料器皿，可以按以下 步骤处理:
加入3mlD-Hanks轻轻晃动后去液体。 加入胰蛋白酶5滴，翻转培养瓶，使消化液浸
没细胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观 察发现细胞质回缩，胞体变圆) 加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动 作要轻柔不要用力过猛。
39
将细胞悬液移至15ml离心管中， 1500rpm*5min离心。
实验总体安排
一.细胞培养的基本技术
实验前准备
细胞传代
细胞冻存与复苏
细胞计数与接种孔板
1
二.专题 1.MTT实验 2.细胞凋亡： JC-1 检测线粒体膜电位 3.免疫荧光技术：核蛋白（PCNA)的免疫荧
光 4.流式细胞仪的应用：细胞周期的检测 5.电镜
2
实验内容
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转染实验操作注意事项
1.进入细胞培养室前带上口罩
2.操作前用75%酒根据需要选择合适的移液枪 5.做好标记
移液枪
移液枪枪头
细胞的传代培养
传代 (passage,subculture)： 当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质 缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养 液，这个过程称为细胞传代。 一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。 培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行
转染对DNA的要求：
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污 染，OD260/280比值应在1.8以上。
报告基因编码的蛋白质非常容易被鉴定，因此常 被用来检测目的基因表达的情况。
常用的报告基因系统: 半乳糖苷酶报告系统 荧光素酶报告系统 荧光蛋白报告系统
关于荧光蛋白
Aequorea victoria水母
残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可 进行1～2次。 4．吸去PBS，加入400µl 0.125％～0.25％的胰蛋白酶，盖 上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细 胞。室温或37°C放置1～2分钟，倒置显微镜下观察，当 观察到细胞收回突起变圆时立即加入800µl的含血清的新 鲜培养基（可37℃预热），终止胰酶的作用，经反复吹打， 制成细胞悬液。
5．细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照1传2或者1 传3等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行 传代。细胞计数时，如果悬液的细胞密度过大，需先按一 定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细 胞的活力。以稀释10倍为例，取10µl细胞悬液，加入到装 有40µl PBS的Ependorf管中，再加入50µl 0.4% 台盼蓝溶 液，混匀后吸出10µl加到计数板上进行一次计数，最终的 细胞数要乘以10。另外，悬液也可收集到管中，离心后用 PBS洗涤。
/Portals/1/Pdf/tb07.pdf
肿瘤细胞株的传代
3.细胞计数 （Counting)
应用计数板或活力检测仪
• 细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）
细胞的传代和计数的实验步骤
1．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。 2．吸去培养皿中原有的细胞培养液 3．培养皿中加入1-2 mL高压灭菌过的PBS，以洗去培养液的
血清培养液中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM中。
转染实验时间安排
第1次操作----形成DNA-脂质体复合物: 1μg DNA(3μl)加入 120μl的OMEM中，轻弹混匀，再加入3μlHilyMax脂质体，轻 弹混匀，室温放置15-25分钟。 第2次操作----复合物加入到细胞培养皿中：吸取全部复合物， 缓慢均匀滴加入培养皿，轻缓混匀。 培养箱培养，第二天中午用荧光显微镜观察转染效果。
可用于特定蛋白、各种细胞结构的标记定位。
GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧 光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子 的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。
RFP-tag
Recombinant protein
Protein1.
Protein2.
细胞转染和传代
实验目的：
理解细胞转染的原理,掌握细胞转染的操作步骤。 学习操净台内操作及注意事项 掌握贴壁细胞传代方法和细胞计数板的使用 学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项。
关于转染（transfection）
细胞转染是指将外源的DNA，RNA等导入真核细胞 的技术，是实验室工作中经常涉及的基本方法。
贴壁细胞消化后的应用：
1. 继续传代培养 2.计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。 3.制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，MTT实 验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取 和分离；洗涤、动物注射等）。
悬浮细胞的传代：离心或更新培养液 贴壁细胞的传代：消化法（0.25%胰酶+0.66mM EDTA)
接种
贴壁 铺展
培养细胞一代的增殖过程
一定密度
体积变大、数
目增多
“汇片”
传代
潜伏期： 有活力，无增殖
指数增长期: 快速增殖， 增殖几次
平台期: 有活力，无增殖
细 胞 数 量
传代培养的实验原理:
传代培养是组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细 胞生物学实验的基础。传代要在严格的无菌条件下进行，每 一步都需要认真仔细的无菌操作。(本次实验因条件限制，只 能在一个模拟的环境下进行实验)
GFP-tag
带标签的重组蛋白
subcellular localization
co-localization
GFP-B23
mRFP-H2B
GFP-SENP3
RFP-B23
关于GFP载体
pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：
①该质粒具有很强的复制能力，可以随宿主细胞分 裂时跟随细胞质成分遗传给新生的子细胞，这是 保证目的基因稳定表达的因素之一。
②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以 使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。
③具有多克隆位点，便于目的基因的插入。
④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功 转染了该载体的靶细胞。
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的
稳定表达
实验材料
HO8910：人卵巢癌细胞系 转染质粒：pEGFP-N1载体，带有荧光蛋白基因的空质粒。 脂质体：HilyMax阳离子脂质体，可应用于转染贴壁 或悬浮细胞的瞬转及稳转，适用于含血清的培养基， 细胞毒性低，效率高且稳定，也能用于转染siRNA。 转染培养液：Opti-MEM，营养条件较好的无血清培养液，在含
外源核酸在细胞中的定位
脂质体转染细胞的优点：操作方便，安全性高。 脂质体转染细胞的原理
转染对细胞的要求：
细胞生长状态决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一 般要求在转染前一日，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺 满培养器皿的60%为宜；转染当日，在转染前4小时换新鲜培养 液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换新鲜培养液。
GFP
绿色荧光蛋白的应用
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个 报告基因(reporter gene)。
利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细 胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体 观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不 影响自身的发光功能 。