荧光光谱法
分子荧光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
原子荧光光谱法
原子荧光光谱法原子荧光谱（AFS）是介于原子发射光谱（AES）和原子吸收光谱（AAS）之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：基态原子（一般蒸气状态）吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态，而后激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光。
一、原子荧光光谱法原理1．1原子荧光的类型以及荧光猝灭（1）共振荧光当原子受到波长为入A的光能照射时，处于基态E0（或处于E0邻近的亚稳态E1）的电子跃迁到激发态E2,被激发的原子由E2回到基态E0（或亚稳态E1）时，它就放出波长入F的荧光。
这一类荧光称为共振荧光。
（2）直跃线荧光荧光辐射一般发生在二个激发态之间，处于基态E0的电子被激发到E2能级，当电子回到E1能级时，放出直跃荧光。
（3）阶跃线荧光当处于激发态E2的电子在放出荧光之前，由于受激碰撞损失部分能量而至E1回到基态时，放出阶跃线荧光。
（4）热助阶跃线荧光原子通过吸收光辐射由基态E0激发至E2能级，由于受到热能的进一步激发，电子可能跃迁至E2相近的较高能级E3,当其E3跃迁至较低的能级E1（不是基态E0）时所发射的荧光称为热助阶跃荧光。
小于光源波长称为反stoke效应。
（5）热助反stokes荧光（略）某一元素的荧光光谱可包括具有不同波长的数条谱线。
一般来说，共振线是最灵敏的谱线。
处于激发态的原子寿命是十分短暂的。
当它从高能级阶跃到低能级时原子将发出荧光。
M*TM+hr除上述以外，处于激发态的原子也可能在原子化器中与其他分子、原子或电子发生非弹性碰撞而丧失其能量。
在这种情况下，荧光将减弱或完全不产生，这种现象称为荧光的猝灭。
荧光猝灭有下列几类型：1）与自由原子碰撞M*+X=M+XM*T激发原子X、MT中性原子2）与分子碰撞M*+AB=M+AB这是形成荧光猝灭的主要原因。
AB可能是火焰的燃烧产物；3）与电子碰撞M*+e-=M+E-此反应主要发生在离子焰中4）与自由原子碰撞后，形成不同激发态M*+A=M x+AM*、M x为原子M的不同激发态5）与分子碰撞后，形成不同的激发态M*+AB=M x+AB6）化学猝灭反应M*+AB=M+A+BA、B为火焰中存在的分子或稳定的游离基2．荧光强度与分析物浓度间关系原子荧光强度I f与试样浓度C以及激发态光源的辐射强度I0存在以下函数关系I f二①I根据比尔一朗伯定律厅叫口•e-KLN]式中：①-原子荧光量子效率I-被吸收的光强I0-光源辐射强度K一峰值吸收系数L一吸收光程N一单位长度内基态原子数按泰勒级数展开，当N很小，则原子荧光强度I f表达式可简化为：I f二①I0KIN当所有实验条件固定时，原子荧光强度与能吸收辐射线的原子密度成正比，当原子化效率固定时，I f与试样浓度C成正比，即I=aC f上式线性关系，只在浓度低时成立。
原子荧光光谱法原理
原子荧光光谱法原理
原子荧光光谱法( AFS) 因化学蒸气分离、非色散光学系统等特性，是测定微量砷、锑、铋、汞、硒、碲、锗等元素最成功的分析方法之一。
原子荧光光谱法（AFS）是介于原子发射光谱（AES）和原子吸收光谱（AAS）之间的光谱分析技术。
原子荧光光谱法原理：基态原子（一般蒸汽状态）吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态，而后激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光。
测量待测元素的原子蒸气在一定波长的辐射能激发下发射的荧光强度进行定量分析的方法。
原子荧光的波长在紫外、可见光区。
气态自由原子吸收特征波长的辐射后，原子的外层电子从基态或低能态跃迁到高能态，约经10-8秒，又跃迁至基态或低能态，同时发射出荧光。
若原子荧光的波长与吸收线波长相同，称为共振荧光；若不同，则称为非共振荧光。
共振荧光强度大，分析中应用最多。
在一定条件下，共振荧光强度与样品中某元素浓度成正比。
该法的优点是灵敏度高，目前已有20多种元素的检出限优于原子吸收光谱法和原子发射光谱法；谱线简单；在低浓度时校准曲线的线性范围宽达3~5个数量级，特别是用激光做激发光源时更佳。
主要用于金属元素的测定，在环境科学、高纯物质、矿物、水质监控、生物制品和医学分析等方面有广泛的应用。
原子荧光光谱分析法具有很高的灵敏度，校正曲线的线性范围宽，能进行多元素同时测定。
这些优点使得它在冶金、地质、石油、农业、生物医学、地球化学、材料科学、环境科学等各个领域内获得了相当广泛的应用。
原子荧光光谱法的特点
原子荧光光谱法的特点介绍如下：
原子荧光光谱法是一种用于分析物质成分的分析技术，其特点如下：
1.高灵敏度：原子荧光光谱法可以检测到非常微量的元素，灵敏度可达到ppb或更低。
2.高选择性：不同元素在原子荧光光谱中具有独特的发射光谱，因此可以实现元素的
高选择性分析。
3.宽线性范围：原子荧光光谱法对元素的检测范围广泛，可以同时检测多个元素。
4.高精确度：原子荧光光谱法具有很高的精确度和重现性，可以满足大多数实际应用
的要求。
5.无需前处理：样品准备简单，不需要进行复杂的前处理，可以直接进行分析。
6.非破坏性分析：原子荧光光谱法是一种非破坏性分析技术，可以对物质进行分析而
不影响其物理和化学性质。
总之，原子荧光光谱法具有高灵敏度、高选择性、宽线性范围、高精确度、无需前处理和非破坏性等优点，在材料分析、环境监测、地质勘探等领域得到广泛应用。
x荧光光谱法
x荧光光谱法X荧光光谱法（X-ray fluorescent spectroscopy，XRF）是现代分析科学中常用的一种无损表面分析技术。
它通过测量物质被激发后放射出的X射线能谱图，从而确定样品中各种基本元素的相对含量和结构信息。
X荧光光谱法具有高灵敏度、高分辨率、广泛适用性等优点，在材料科学、地球科学、环境科学、矿业勘探等领域有着广泛的应用。
本文将详细介绍X荧光光谱法的原理、仪器设备以及应用领域。
一、X荧光光谱法的原理1.1 X射线的产生和相互作用X射线是电磁波谱中波长最短的一种辐射。
X射线的产生主要有两种途径：一种是由高能电子通过急剧的减速过程产生的，称为广义X射线；另一种是由高能粒子与物质相互作用而产生的，如β粒子与重原子核相互作用产生的射线，称为硬X射线。
当高能电子与物质相互作用时，会发生三种主要的相互作用过程：电离作用、激发作用和散射作用。
这些相互作用过程对物质的特性有很大的影响。
其中，电离作用是指电子与物质原子中的电子发生碰撞，导致电子被打出原子，产生电离现象。
激发作用是指电子与物质原子中的内层电子发生碰撞，使内层电子被激发到高能级，然后返回基态时放出能量。
散射作用是指电子与物质原子中的电子发生弹性碰撞，改变方向后出射。
1.2 X荧光光谱法的原理X荧光光谱法是利用物质受激发后放射出的X射线能谱图来分析样品中的成分和结构信息。
当X射线照射到物质上时，物质原子的内层电子可以被激发到高能级，然后返回基态时会放出能量。
这些能量的大小和原子的电子能级差有关，不同元素的电子能级差是不同的。
当物质被X射线照射时，其中的原子会被激发，激发后返回基态时放出的能量就形成了一系列特定的X射线能谱线。
这些能谱线对应着不同元素的电子能级差，因此可以通过测量物质放射出的X射线能谱图来确定样品中各种基本元素的相对含量和结构信息。
1.3 X荧光光谱法的仪器设备X荧光光谱法主要的仪器设备有X射线发生器、样品支架、能谱仪和数据处理系统。
原子荧光光谱法的基本原理
原子荧光光谱法的基本原理1.激发：在原子荧光光谱法中，样品首先通过电热或激光等方法被激发到高能级。
2.脱激：激发态的原子由于能级不稳定会迅速退回到稳定的低能级上。
在这个过程中，原子释放出能量。
3.荧光：退回过程中释放出的能量转化为荧光，即在可见或紫外光谱范围内的辐射。
4.探测：激发和荧光辐射的波长可以通过荧光光谱仪测量和记录下来。
1.光源：原子荧光光谱法使用与样品中元素特征光谱线匹配的激发光源。
激发光源可以是电热元件、激光或灯泡等。
2.样品制备：样品可为固态、液态或气态，根据样品的物理性质采用相应的样品制备方法，如固态样品需研磨成细粉末。
3.激发：将制备好的样品与激发光源接触，使样品中的元素被激发到高能级。
4.脱激：激发的原子通过自发脱激等机制退回到稳定的低能级，并释放出能量。
5.荧光辐射：退回过程中释放出的能量转化为荧光辐射，其波长位于可见或紫外范围内。
6.光谱检测：荧光辐射经过荧光分光仪后，可通过单光子计数器测量并记录下来。
7.数据处理：通过比较测得的荧光光谱与标准样品的光谱，可以确定样品中各元素的存在和含量。
1. 高灵敏度：原子荧光光谱法对大多数元素具有较高的灵敏度，可以检测到低至ppb甚至ppt级别的微量元素。
2.高选择性：原子荧光光谱法可以选择性地测量元素的荧光辐射，不受样品基质的影响，适用于复杂基质的分析。
3.宽线性范围：原子荧光光谱法在不同元素的不同浓度范围内都有较好的线性关系。
可以在宽范围内测量元素的含量。
4.快速分析：原子荧光光谱法测量速度快，可实现快速和高通量的分析。
5.多元素分析：原子荧光光谱法可以同时测量多个元素的含量，高效和经济。
虽然原子荧光光谱法具有许多优点，但也存在一些限制，如仅能测量低至ppb级别的元素含量，并且对氢、氧等低原子序数元素的检测灵敏度较低。
总之，原子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，广泛应用于环境、化学、生物等领域中，可用于元素的定性和定量分析。
原子荧光光谱法的基本原理
原子荧光光谱法的基本原理
原子荧光光谱法的基本原理是根据激发源（如离子源）对样品中元素结构的电磁场剖面强度探测，再得出元素的存在。
它通过离子源向样品中产生电磁场，让样品中的原子电子发生电离以及激发，致使样品中的原子电子发生放射性，从而产生原子荧光光谱，利用这些荧光光谱中谱线的强度及峰位的变化，可以确定样品中具体的元素组成，从而可以得到样品中元素的含量。
总之，原子荧光光谱法的主要原理是根据激发源（如离子源）对样品中元素结构的电磁场剖面强度探测，再得出元素的存在。
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7
A.发射光谱的波长比激发光谱的长 ， 振动弛豫消耗了能量。 B.发射光谱的形状与激发波长无关
萘的激发光谱、荧光光谱、磷光光谱
8
4、荧光的影响因素
1）分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可见光）相适应 的结构（共轭π键），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定 的荧光量子产率。
21
五、数据处理：
1．用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作 曲线。 2．根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准 工作曲线上求得其浓度。
22
问题与思考
• 激发波长与荧光波长有何关系？为什么？ • 测定过程中应注意哪些问题？
f
发荧光的分子数 激发分子的总数
与化学结构有关
f
Kf Kf
Ki
与化学环境（如： 溶剂、酸度、温 度）及结构有关
10
11
12
荧光量 子产率
5、溶液的荧光（或磷光）强度
If =2.3 I0 kbc
当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If = K c
摩尔吸 光系数
吸收 光程
即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系 只有在极稀的溶液中，当 kbc0.05时才成立。
实验：荧光法测定维生素B2
片剂中核黄素含量
主讲教师：许 兢
一、背景知识
原子吸收
原子光谱
原子发射
原子荧光
光谱分析 分子吸收 分子光谱 分子发光
紫外-可见光谱
红外光谱
2
红外 红外
紫蓝緑 蓝 緑 黄 黄 橙 红 蓝緑 緑
波長
200nm
400nm
800nm
1、分子发光分析
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态得到
5
3、荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(Ex)
以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧光最强的波长处 测量荧光强度即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为纵坐 标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。 发射光谱：(Em)
固定激发光波长（最大）然后测定不同的波长时所发射的
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，
使荧光强度和浓度不呈线性关系。
13
6、荧光分光光度计
波长范围：200~800nm
扫描激发光谱，选择激发波长
激发单色器
最广泛应用的连续光源
光源 氙 灯
样品池
光电倍增管
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
光源
数据处理 仪器控制
激发 单色器
样品池 发射 单色器 检测器 数据处理 仪器控制
扫描发射光谱
发射单色器
消除干扰
7、分子荧光分析法
1） 荧光分析方法的特点 灵敏度高；选择性强；试样量少和方法简单 2）荧光定量分析的方法 标准曲线法：荧光强度与荧光物质浓度成正比关 系
方法
比较法：同样条件下，测定试样溶液和一标准溶 液的荧光强度，直接通过比例计算
370、441 nm有三个峰。然后将激发波长设定在370 nm处，
在400－700 nm波长范围内对荧光波长扫描，记录荧光光谱 曲线，约在525 nm处荧光强度最大。从激发和发射光谱上
确定最佳的激发和发射波长。
20
3、标准系列溶液的配制
在五个干净的50 mL容量瓶中，分别加入1.00 mL，2.00 mL，
3.00 mL，4.00 mL和5.00 mL．定容至50 mL。 4、标准溶液的测定 设臵适当的仪器参数, 在最佳激发波长和发射波长处从稀 到浓测量系列标准溶液的荧光强度。
5、未知试样的测定
取待测液5.0 mL臵于50 mL容量瓶中，用5% HAc溶液稀释至 刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光 强度。
15
吸光谱图
激发光谱图
荧光
（a）吸光法
（b）荧光法
二、实验目的：
1．加深对荧光光度法原理的理解; 2．巩固荧光光度计的基本操作; 3．掌握用荧光光度法测定维生素B2的原理。
三、实验原理：
维生素B2,即核黄素
荧光性质： 水溶液在430-440 nm蓝光或 紫外光照射下会发生绿色荧光， 荧光峰在535 nm, 在pH=6-7溶液 中荧光强度最大，在pH=11的碱 溶液中荧光消失 化学性质： 对酸稳定，碱性条件下易于 分解，光敏感
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光
磷光
4
化学发光
2、荧光和磷光的产生
振动能级 电子所处的能级 分子中电子 的能量状态 电子的多重态 转动能级
S=0, J=1
单重态S表示
三重态 T表示
J=2S+1
S=1, J=3
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态得到
四、实验步骤：
1、试剂溶液的配制
1）10.0 mg·L-1VB2标准溶液：准确称取10.0 mgVB2将其 溶解于少量的5%HAc中，转移至1L容量瓶中用5%HAc稀释 至刻度，该溶液应装于棕色试剂瓶中，臵阴凉处保存。 2）待测液：取市售VB2一片，臵于50 mL烧杯中，加入约 12mL 5%HAc溶液，用玻璃棒捣碎药片，（水浴加热使样 品由混浊变为基本透明后取下冷却，）转移并加入5%HAc 溶液定容至100 mL。（取数毫升于离心管中进行离心，
）用移液管准确移取5 mL的上层清液并定容成50 mL，贮
于棕色试剂瓶中，臵阴凉处保存。
19
2、激发光和荧光波长的选择 准确移取10.0 mg·L-1VB2 标准溶液2.5 mL于25 mL容
量瓶中定容。转移部分溶液至石英比色皿中，将荧光分光
光度计的荧光波长暂定在525 nm处，在200－500 nm波长范 围内对激发波长进行扫描，记录激发光谱曲线，约在263、