整个基因克隆实验流程(完整)

一、组织总RNA的提取
相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水
相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。

相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。

实验步骤
1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入
液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。

2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；
3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；
4.4℃，,12000g 离心15min；
此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；
5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，
加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；
6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；
7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；
8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；
9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min
晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）
10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。

RNA质量检测
相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）
相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）
相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）
（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。

（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。

当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

二、逆转录（RNA逆转录成cDNA）
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl 冰盒，制冰机，PCR管）
根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下：
试剂使用量（μl）
Rnase Free H2O 11.75-Y
Oligo（dT） 1
Total RNA（<1000ng）Y
Total Volume 12.75
65℃，5min后，立即置于冰上。

试剂使用量（μl）
上一步变性后RNA溶液12.75
5×RT Buffer 4
dNTP Mixture（各10mM） 2
Rnase Inhibitor（10U/μl）0.25
Rever Tra Ace 1
Total V olume 20
然后放置于PCR仪上，反应程序为：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。

所得cDNA放置于-20℃保存。

三、PCR反应
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl 电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
试剂使用量（μl）
ddH2O 6.0
反转录产物 1.0
10×PCR Buffer 1.0
dNTP（10mmol/l）0.2
Taq酶（1U/μl）0.4
Ghrelin-F（10μmol/l）0.4
Ghrelin-R（10μmol/l）0.4
MgCl2（25mmol/l）0.6
Total V olume 10
反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

四、PCR产物的分离，回收和纯化
相关试剂：胶回收试剂盒
相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）
相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）
PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。

将所得DNA贮存于-20℃。

五、目的片段与载体的连接
相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。

pMD-18T载体1μl
DNA 2μl
ddH2O 2μl
然后加入5μl Ligation Mix，4℃/16℃放置过夜连接。

六、转化
相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
◆CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞
全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。

（1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h；（2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h；
（3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低）
（4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min；
（6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min；
（7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清；
（8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml 预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。

-80℃保存备用。

◆连接产物转化到感受态细胞
（1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min；
（2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；
（3）加入890μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min；
（4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，均匀涂布于含Amp 的LB固体培养基平板上；
（5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。

（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生）
七、菌液PCR检测
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。

3000rpm离心3min后吸掉上层400μl上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。

挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。

附注：
主要溶液和培养基的配制
1）电泳缓冲液10×TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0；
2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH 调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存；
3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min 后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存；
4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。

使用时终浓度为100ug/ml。

5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml 双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；
6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存；7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃保存备用；
（dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 173’
接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’
2.cDNA的纯化
利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。

最后使用20μl TE洗脱沉淀。

2.cDNA的纯化
利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。

最后使用20μl TE洗脱沉淀。

行下游实验。