特殊细菌药敏试验规范化操作
细菌室支原体培养鉴定及药敏操作规程
细菌室支原体培养鉴定及药敏操作规程
1．原理及依据标准：
支原体分离鉴定培养基用于泌尿生殖道支原体(解脲支原体Uu和人型支原体Mh)的检测与诊断。
当有Uu和Mh生长，分解尿素和精氨酸引起PH上升，使以酚红为指示剂的培养基由黄转红。
依据珠海迪尔生物工程有限公司生产的试剂盒说明书。
2．标本的采集：
2.1、男性：用特别细的无菌棉拭子沾取无菌生理盐水少许深入尿道口内2～2.5cm处取分泌物，前列腺液亦可用沾取无菌生理盐水的无菌棉拭子尽量多的沾取。
2.2、女性：用沾取少许无菌生理盐水的棉拭子取宫颈内口1～2cm处单层柱状上皮细胞，取样拭子不可碰阴道壁。
2.3、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应立即送检。
整个采样过程应注意无菌操作。
3、标本接种：(本实验应注意无菌操作，避免污染杂菌)
3.1、取出培养基，放置接近室温，并在瓶盖上编号。
3.2、将采集的标本拭子插入培养瓶中，在靠近液面上方的瓶壁挤示压旋转拭子数次，使拭子中标本渗入到肉汤中：若为液体标本，取200 u 1加入培养基中；若为中段尿，经3000转／分离心15分钟取沉渣100ul 加入培养基中。
3.3、盖上瓶盖，置35～37℃孵箱，在24～48小时分别观察结果。
4、结果判读：
培养基变红，判断阳性，培养基黄色并清亮，判断阴性。
5、已检标本处理：密闭容器高压灭菌后，按医用垃圾处理。
抗菌药物敏感性试
• 在贴条过程中， 90mm 平皿只能贴 2 条，同时不同的试纸条高浓度 的一段应该向背；若贴 2 条含有酶抑制剂的试条应将含有酶抑制剂的 一端贴在同一侧。 • 贴条注意事项：试条事先恢复室温： 10 分钟左右。 • 试条的数量与角度： 4-6 条、 1-2 条。 • 贴条的时间：平皿多余水分已经消失。 • 试条的方向：高浓度端向外。 • 贴条的动作：平稳、流畅、不拖拉。 • 气泡的处理：尽量向一端赶。 • 3.孵育同 K-B 法 • 注意孵育时间、环境温度及酸碱度。 • 读数原则：杀菌剂读清晰的边缘见图 1 ，抑菌剂读大菌落与小菌落的 交界见图 2 。变形杆菌读最小的 MIC 值，后两张为含酶抑制剂抗生 素的测试结果。
抗菌药物敏感性试验规范化 卫生部北京医院 艾效曼
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学习目标 1 、了解抗菌药物敏感性试验的意义、我国抗菌药物敏感性试验应遵循的规 则。 2 、掌握纸片扩散法和 E 试验原理，牢记试验的操作步骤及各步骤中的注意 事项，在日常工作中进行规范化的操作。
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抗菌药物敏感性试验的意义是什么？我国抗菌药物敏感性试验应遵循哪些规 则？ 一、基本内容 药敏试验的意义： （一） 药敏试验的意义： 1.查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用。 2. 进行 耐药监测 ，为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠 依据。 3.利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使 用寿命。 4. 为新药的研究和评估提供有价值的信息。 ）、药物敏感试验规则 （二）、药物敏感试验规则
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目前世界上通用的规则是德国和欧洲标准，而我国主要以临床试验室标准化 委员会（ CLSI ），即美国国家实验室标准委员会 (NCCLS) 的规则为标准， 这个标准主要包括 CLSI 纸片扩散法（ M2 ）和需氧菌稀释法（ M7 ）。 ）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 （三）、抗菌药物敏感性试验结果参照标准 1.标准的正确使用 M100 – 即新表 M100-S17 ，每年更新 1 次；包括 M2 和 M7 文件， M2 – 即 纸片扩散法 (DD) 文件 M2-A9 ， M7 – 即 MIC 文件 M7-A7 。 M2 、 M7 文 件每 3 年更新一次 ；使用文件时应注意文件是否已更新，避免使用旧文件造 成判断结果失误。 2.获得文件的方法 如果购买厂家的纸片可向厂家索取标准，每年国际化会议也会颁发此文件的 中心内容。 表内容： （四）、 CLSIM-100 表内容： CLSIM-100 表主要包括版本中的更新要点、各版本抗菌药物分组、 M2 纸片 扩散法用的表、 M7 MIC 用的表、 M7 MIC 用的表及词汇表等内容。
支原体药敏试验操作方法
支原体药敏试验操作方法
支原体药敏试验是对支原体细菌进行敏感性测试，以确定它们对不同抗生素的敏感程度。
操作方法如下：
1. 支原体细菌的筛选：首先选择纯化的支原体细菌株，应当检查其纯度和生长状态。
2. 制备试验用平板：使用Mycoplasma agar制备支原体药敏试验的平板，其中包含需要测试的抗生素。
将平板温度调节在35~37之间。
3. 制备菌液：从培养基中收集支原体细菌并转入到PBS缓冲溶液中，用垫头过滤以去除未破裂的细胞。
4. 稀释菌液：将菌液根据需要的浓度逐渐稀释，通常为10^5~10^6 CFU /ml，以便于试验处理。
5. 接种平板：将菌液滴入含有抗生素的药敏试验平板中，用琼脂种培养。
6. 培养：将培养皿放入条件恰当的恒温孵化箱或培养箱中，恒温为35~37，将培养皿培养约3~5天。
7. 判断：在生长完全的区域观察菌落数量、生长状态等信息，根据指南判断其
敏感性和耐药性。
8. 结论：根据支原体所产生的菌落数量和生长状态，分析支原体对药物的敏感性或耐药性。
注意事项：
1. 操作过程中应保证操作环境的无菌性。
2. 需要严格按照试剂及培养基的说明书进行操作。
3. 在菌液制备及接种过程中要严格注意细菌的数量及浓度。
4. 抗生素在试验过程中的使用必须符合相关法律法规。
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法是一种常用的检测细菌对抗生素敏感性的方法，其操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如Mueller-Hinton（MH）琼脂（常用于细菌药敏试验）。
按照制造商的
说明溶解固体培养基，并加入适当量的琼脂（通常为2%），
将其加热溶解，然后用无菌盘口装好。
2. 菌液制备：从培养基上的细菌菌落中接种一根病菌棒，将其浸入含有3-5毫升无菌盐水的试管中。
3. 菌液浓度调整：将试管中的细菌菌液用比例稀释至合适的浓度（通常为0.5麦克百尼尔/毫升）。
4. 纸片扩散：用无菌的棉签将稀释后的菌液均匀地涂抹在一块布拉格琼脂平板上，然后在琼脂上按要求摆放敏感纸片（一般为阿莫西林、头孢菌素等常用抗生素），注意要与纸片相距一定距离。
5. 培养：将布拉格琼脂平板反面朝上，用无菌培养皿盖好，然后放入恒温培养箱中进行孵育。
通常在35-37°C条件下培养
24小时。
6. 结果录入和解读：观察纸片周围的细菌生长情况，通过测量纸片周围形成的抑制圈直径来评估细菌对不同抗生素的敏感性。
根据抑制圈的直径大小，将细菌的敏感性分为敏感、中等和耐
药三个等级。
注意事项：
- 操作过程需要严格无菌，以免细菌的外源污染影响结果。
- 确保培养皿紧闭，避免细菌的空气传播。
- 操作前后要做好清洁，避免微生物交叉感染。
- 移栽过程要注意避光，避免紫外线对细胞的破坏。
与耐药机制有关药敏试验的规范化-陈东科
1. 苯唑西林纸片筛选试验
方法：使用含1μg苯唑西林纸片（而不是甲氧西林 或萘夫西林）来检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。 用直接菌落悬液法制备的接种物（0.5麦氏比浊浓度 菌液）接种MH琼脂平板， 待琼脂表面的水份干后， 贴苯唑西林纸片，于33℃-35℃孵育24h，测量抑菌 圈直径。
结果判断：按NCCLS/CLSI解释标准判断结果，金 黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径≤10mm为 耐药，≥13mm为敏感。除路邓葡萄球菌外的其它凝 固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤17mm为耐ห้องสมุดไป่ตู้， ≥18mm为敏感。
注意事项
（1）在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌
圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如有说明耐药。
（2）试验温度超过35℃不能检测MRS。
（3）纸片扩散法结果如有疑问，必须进行mecA 基
因或PBP2a 测定、头孢西丁纸片试验、苯唑西林 MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否
为MRS 菌株，选择其中一种试验结果进行报告。
检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐
药（如图）。
注意事项：
为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药 菌株，需要将琼脂平板孵育48小时。
3. 头孢西丁纸片法
方法： 应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂
平板，使用含30μg头孢西丁纸片， 35℃孵育24h（如 耐药则在孵育18h后可报告结果）。使用反射光阅读
药性，头孢西丁纸片试验是首选方法（因为头孢西丁
较苯唑西林的敏感性高，如图）。
4. mecA 基因及PBP2a 测定
方法：可采用乳胶凝集或分子生物学等方法 进行检测（有成品试剂供应）。
结果判断：mecA 基因或PBP2a（mecA 基 因表达产物）检测阳性的葡萄球菌分离株，
与耐药机制有关药敏试验的规范化
与耐药机制有关药敏试验的规范化与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。
前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。
耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。
因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。
在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。
但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。
真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。
我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。
本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。
也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。
包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。
第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。
首先介绍青霉素酶的检测。
检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。
其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的β- 内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。
头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生β- 内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。
方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。
质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。
注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行β- 内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。
药敏试验操作方法
药敏试验根据美国临床标准委员会 ( NCCLS )推荐的 K-B 琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林 ( AMP )，阿莫西林/克拉维酸 ( AMC )，头孢噻吩 ( CFT )，头孢噻肟 ( CTX )，庆大霉素 ( GEN )，萘啶酸( NAL )，诺氟沙星( NOR)，四环素( TBT)，利福平 ( RFA)，复方新喏明( SMZ )。
(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养 16~18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于 3ml 生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管( 0.5麦氏单位)相同。
(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个 M-H 培养基表面，反复几次，每次将平板旋转 60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。
每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm ，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
在菌接种后15分钟内贴完纸片。
(4)将平板反转，孵育18~24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录(附表 5 )。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
(1)制备 MH 琼脂平板应用直径 90mm 平皿，在水平的实验台上倾注。
琼脂厚为4±0.5mm(约 25-30ml 培养基)，琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在 5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。
倾注平皿前应用 pH 计测 pH 值是否正确(pH 应为7.3)。
pH 过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程1．目的规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。
2．原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
3．试剂M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。
4．质控4.1 常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。
4.2 质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。
质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信。
4.3 质控的频率由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作1～2次质控菌株的测定。
如果发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。
如果连续30日失控<3次的，可以恢复每周1次。
5.操作步骤5.1 挑取4～5个纯培养菌落，接种于3～5ml M-H肉汤（0.5麦氏单位）中，经35℃培养6～8h。
5.2 用无菌生理盐水或M-H肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同。
5.3 用无菌棉拭蘸取校正过的菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个M-H平板表面，再重复两次，每次旋转平板60°，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭涂布平板四周缘一圈。
5.4 涂布菌液的平板于室温中干燥3～5分钟后，用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，直径90mm的平板宜贴6张药敏纸片。
5.5 将贴好纸片的平板置35℃孵育18～24小时后，用卡尺量取抑菌圈直径。
个别菌孵育温度，时间及条件应按照CLSI规定。
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特殊细菌药敏试验的规范化操作一、目前我国细菌药敏试验现状20年以来，我国在卫生部和各地临床检验中心和检验学会的共同努力下引进CLSI药敏系列标准，使全国微生物实验室能在同一标准下进行质量控制活动。
当前，微生物实验室对常见临床分离细菌的药物敏感试验的水平已有了显著的提高，但对特殊细菌的药敏试验的各个环节的规范操作还不能得到普及，对目前还无折点的细菌能否做药敏试验，以及如何判断细菌的药物敏感和耐药，仍然概念模糊，有待进一步规范和普及。
目前常见错误做法：（一）铜绿假单孢菌的药敏判断标准用于其他非发酵细菌；嗜血杆菌的标准用于卡他莫拉菌等的错误做法时有发生。
（二）借用同属细菌敏感标准（三）借用同类抗生素的敏感标准二、各菌属的药物敏感性报告及试验方法的CLSI药敏标准（一）“嗜麦芽”菌属药敏报告标准1.CLSI对“嗜麦芽”纸片药敏判断标准2.CLSI对“嗜麦芽”稀释法判断标准（二）无折点细菌的药物敏感试验报告1. 其他药物的敏感性报告: CLSI推荐的药物可以报告MIC值和敏感度（S、I、R），临床需要的其他药物的药敏试验报告可以直接报告MIC值但不报告S、I、R。
2. 不要用认为相近细菌的折点代替报告S、I、R，这会误导医生用药。
（三）洋葱伯克霍德菌的药物敏感试验1.CLSI 洋葱伯克霍德菌纸片法折点：2. CLSI洋葱伯克霍德菌稀释法折点：（1）氯霉素不常规报告结果,只有在尿路感染时分离的细菌才报告结果。
（2）在纸片法药敏中只允许报告表中4个药物的敏感性,对其他药物可用于临床治疗但还没有足够的研究建立纸片扩散的折点。
（四）莫拉菌属的药物敏感试验报告莫拉菌属至今尚无由CLSI颁布的标准操作方法和敏感性折点,该菌属是人体皮肤、黏膜、呼吸道正常细菌，很少会致病，有过报道的病例有该菌属引起的眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、脑脓肿、心包炎和心内膜炎。
实验室药敏报告只能报告MIC 值但不能报告敏感性。
文献报告的资料是推断性。
（五）金黄杆菌属的药敏试验报告脑膜败血性黄杆菌是最常见于临床标本，是条件致病菌，有文献报道的病例有新生儿脑膜炎，对成人很少致病，感染与插管有关。
CLSI未颁布标准操作方法和敏感折点，药敏试验可报告MIC值。
该菌属耐药特点：对氨基糖甙类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类天然耐药；对治疗革兰阳性细菌药物利福平、红霉素、克林霉素、司帕沙星、复方新诺明和万古霉素敏感。
（六）丛毛菌属和食酸菌属的药敏试验推荐用肉汤稀释方法或E-test方法，报告MIC值，不适合用纸片药敏方法。
（七）产碱杆菌属、无色杆菌属和苍白杆菌属的药敏试验目前无药敏解释标准，建议采用稀释法药敏试验方法，报告MIC值，根据MIC和组织浓度判断敏感性。
1．粪产碱杆菌是产碱杆菌的代表株对氨苄西林、氨曲南和庆大霉素耐药。
2．木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种是临床常见的分离株，对氨苄西林、氨基糖甙类、非抗假单孢菌的头孢菌素、氟喹诺酮和氯霉素耐药，但对派拉西林、替卡西林/棒酸、亚胺陪南、复方新诺明及抗假单孢菌头孢菌素敏感。
3．人苍白杆菌是苍白杆菌属代表菌，对β-内酰胺类耐药，但对亚胺陪南、复方新诺明、氨基糖甙类、氟喹诺酮类和四环素敏感。
（八）布鲁杆菌属药敏试验不推荐做体外药敏试验，β-内酰胺类耐药和氟喹诺酮类有高的体外活性与临床疗效不一致。
热病推荐首选药物是多西环素加庆大霉素或链霉素。
（九）军团菌药敏试验目前无标准的试验方法和解释标准，肉汤稀释和E-test方法报告MIC值可作参考。
首选用药大环内脂类、喹诺酮类，对β-内酰胺类体外敏感但体内疗效差。
（十）弯曲菌科细菌的药敏试验1．弯曲菌科包括弯曲菌属、弓形菌属和螺菌属。
目前无解释标准。
CLSI M100-S16 2006年文件仅提供了质控菌株对部分抗生素的可接受范围和质量控制标准操作程序。
2．常寄生于人的牙周黏膜，可引起人胃肠炎和腹泻，胎儿弯曲菌可引起免疫低下患者菌血症。
热病推荐对空肠弯曲菌首选药物为红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、多西霉素和克林霉素。
幽门螺杆菌对克林霉素的折点是1ug/ml并与临床疗效一致，甲硝唑在体外敏感试验没有标准。
（十一）厌氧细菌的药敏试验由于大多数用于厌氧细菌感染的药物对临床有很好的预期效果，所以并不推荐做常规的厌氧菌药敏试验,但在严重厌氧菌感染而常规治疗疗效差的情况下有必要测定致病菌的MIC值,指导用药;在新药评价时需要做厌氧菌的药敏试验,用MIC值评价药效学。
随着厌氧细菌感染率的增长，厌氧细菌的耐药性也在不断增长，特别是脆弱拟杆菌已有报道对亚胺培南和甲硝唑的耐药株报道，几乎所有的脆弱拟杆菌均产生β-内酰胺酶，部分菌株产生超广谱β-内酰胺酶。
越来越多的梭杆菌产生β-内酰胺酶导致对β-内酰胺酶抗生素耐药。
（十二）真菌的药敏试验由于真菌药物敏感试验影响因素颇多，如真菌生长的速度、药物在体内的代谢、培养条件等，所以真菌药敏试验结果与疗效的一致性至今是本领域需要探讨的重要课题。
1.酵母样真菌药敏试验（1）酵母样真菌的药敏折点 1992年，NCCLS起草了《酵母菌的液体稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案》文件名称为M-27P，用于检测引起深部感染的酵母样真菌，包括念珠菌、光滑球似酵母和新生隐球菌等菌对两新霉素-B（AmB）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）等的敏感性；1995年NCCLS对该草案作了修正，增加了微量稀释法起名为（M-27T）；1995-1997年NCCLS对终点判断方法进行了修定，形成了《酵母菌稀释法抗真菌药敏试验实施方案》（M-27A）；2002年NCCLS 统一了微量稀释法中24h和48h终点判断方法，增加了新的抗真菌泊沙抗唑（posaconazole）、雷夫康唑（ravuconazole）和伏力康唑（vuliconazole VCZ）的试验方法和MIC参照范围，并将该方案修定出版，名为M-27A2。
（2）CLSI对酵母样真菌现有的标准（3）CLSI对酵母样真菌纸片法判断标准2. 丝状真菌药敏试验（1）丝状真菌的药敏折点：初始方案产生于1998年，命名为M-38P，该方案包括微量稀释法和洪量稀释法，对曲霉菌、镰刀菌、波氏假阿利什曼等丝状真菌有较好的一致性；2003年NCCLS对某些最低抑菌浓度（MIC）判定方法及影响因素作了多中心的研究和修正，并增加了新三唑类药物的试验方案，从此产生了现在用于实验室药敏试验和新药评价的常规方法M-38A。
（2）丝状真菌药敏报告：CLSI颁布的M-38P是丝状真菌肉汤稀释法抗真菌药敏试验,内容并无丝状真菌敏感性折点，只是描述了测试方案，包括试剂配制、操作方法、质量控制等程序。
3．关于真菌药敏报告（1）Candida.Krusel(克柔假丝酵母)对氟康唑天然耐药,现已颁布的氟康唑对念珠菌的判断标准不适用，不管体外药敏结果均应报告耐药。
（2）AMB对念珠菌目前无判断标准。
（3）伊曲康唑的折点仅适用于黏膜念珠菌感染,对侵袭性感染时全身性用药并不适用，建议仅报告MIC不报告S、I和R。
（4）对5-FC现有的标准是基于联合用药情况下的敏感折点，如单独用药，该标准不适用。
（5）卡泊芬净至今无体内外相关性好和重见性稳定的药敏试验方法，至今无评定标准，但有报道可用MEC，即最低有效浓度（能使真菌形态发生改变的最低药物浓度），用于评价药物的有效性。
4．E-test方法适合哪些真菌的药敏试验E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，包括酵母样真菌，如念珠菌、隐球菌状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等的药敏测试。
5.正确报告FUNGUS-3的规范方法（1）FUNGUS-3试条中氟胞嘧啶只有2个稀释浓度，一个高浓度，一个低浓度，报告以敏感度报告；（2）当两个浓度均有菌生长,并生长超过80%,报告耐药“R”。
（3）当高浓度真菌被抑制80%或以上,低浓度孔真菌完全生长或生长80%报告“SDD”。
（4）当两个浓度均无真菌生长报告敏感“S”。
（5）可通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况：肉眼判读前，建议把试条放在黑暗的背景下（可从bioMerieux得到ATB FUNGUS 3可视化判读器）。
对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照比较，在结果记录纸上记下每一个杯的生长得分。
（6）正确报告FUNGUS-3的药敏结果的方法：对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）是生长完全被抑制的测试杯的浓度（得分为“0”的测试杯）；对于氟康唑（FCA）, 伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC），鉴于可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度（MIC）对应的测试杯得分可以是生长得分为“2”，“1”，或是“0”分。
需要注意的是：在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。
例ATB FUNGUS 2如下图三.MIC在真菌感染临床治疗中的指导意义在临床应用中，按日剂量与MIC比值大于50的剂量用于严重真菌感染，日剂量与MIC值比值为25的剂量用于一般真菌感染的原则被应用。
也有文献提示，临床实践证明当抗真菌药物MIC值大于2ug时，疗效差，死亡率高。
含MIC的真菌药敏报告对临床治疗更有价值。
（一）抗真菌药敏试验与临床的相关性ICZ法中MIC≤0.125ug/ml敏感，0.25-0.5ug/ml剂量依赖敏感，≥1.0ug/ml为耐药。
如给药400mg/d,MIC1.56ug/ml为耐药； MCZ治疗泌尿系统白念感染，如耐药，其MIC可上升100倍；KCZ治疗CMCC，白念如果耐药，对其他唑类可交叉耐药。
5-FC耐药的MIC为≥32ug/ml，敏感值为≤4ug/ml；AmB试验耐药菌株有白念、热带、葡萄牙念珠菌，MIC大于0.8ug/ml 可以死亡，NCCLS法不太适合。
但耐药一般为＞1.0ug/ml。
FCZ试验中一般剂量依赖耐药为16-32ug/ml，但64ug/ml即为耐药。
也可以说，组织药物浓度的测定是联系药敏试验和临床用药的桥梁。
以FLC为例：（二）体外抗真菌药敏试验与体内疗效的一致性NCCLS M27-A试验研究中：600余株念珠菌MIC值，分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC 值大于64 μg/ml，并显示MIC值与临床疗效成90-60原则，即：药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效；药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效（Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989）。
体外抗真菌药敏试验指导用药，以FLC为例：（三）真菌药敏试验的应用原则当疾病为孤立的粘膜念珠菌病时，建议经验性治疗，不做药敏；当为复发的粘膜念珠菌病时，建议菌种鉴定，如果治疗失败应该考虑到药敏；当高危患者中念珠菌定植时，建议菌种鉴定，建立当地药敏试验流行病学资料，应该经验性治疗，当为念珠菌血症及深部感染时，建议鉴定，应用唑类药物时应该考虑药敏试验，并定期掌握当地药敏试验流行病学资料；当患者为深部感染需要延长治疗时，建议对所有菌株都测药敏（Hopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160）。