荧光定量pcr法原理汇总
荧光定量PCR原理及实验步骤精选全文
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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量PCR原理及应用一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。
本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。
二、荧光定量PCR原理2.1 PCR基本原理回顾在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。
1.变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。
2.引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。
引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。
引物结合到待扩增片段上。
3.延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。
通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。
2.2 荧光定量PCR原理荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。
荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。
1.引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。
2.荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。
3.荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。
TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。
在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。
4.实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理
荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的PCR技术，可以用于检测和定量DNA或RNA的存在量。
它是PCR技术的一种改进，通过引入荧光探针来实现实时监测PCR反应的过程，从而实现定量分析。
荧光定量PCR的原理基于PCR技术，PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过引物与DNA模板的特异性结合，使DNA模板在酶的作用下进行多轮扩增。
荧光定量PCR在PCR反应中加入荧光探针，荧光探针与PCR扩增产物结合后，荧光信号会随着PCR反应的进行而增加，从而实现实时监测PCR反应的过程。
荧光定量PCR的荧光探针通常包括两种类型：探针和引物。
探针是一种含有荧光染料和荧光猝灭剂的寡核苷酸，它与PCR扩增产物的特定序列结合后，荧光信号会被释放出来。
引物是一种与PCR扩增产物的特定序列互补的寡核苷酸，它与探针共同作用，使探针与PCR扩增产物结合。
荧光定量PCR的反应过程包括三个步骤：扩增、荧光信号检测和数据分析。
在扩增过程中，PCR反应体系中的DNA模板与引物结合，酶的作用下进行多轮扩增。
在荧光信号检测过程中，荧光探针与PCR扩增产物结合，荧光信号被释放出来，并被荧光检测器检测到。
在数据分析过程中，荧光信号的强度与PCR扩增产物的数量成正比，通过标准曲线可以计算出PCR反应体系中的DNA或RNA的存在量。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和高重复性等优点，可以用于检测和定量DNA或RNA的存在量。
它在医学、生物学、环境科学等领域有着广泛的应用，如病原体检测、基因表达分析、环境污染监测等。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
荧光定量PCR原理及应用
荧光定量PCR原理及应用首先，PCR反应：荧光定量PCR使用特异性引物将目标DNA序列扩增。
PCR反应通常包括以下步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系中的DNA双链被加热至95°C，使其变性成两个单链。
随后，在退火温度下，引物与目标DNA的互补序列结合。
最后，在延伸温度下，DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。
这些步骤会重复多次，每次都会使目标DNA序列的拷贝数翻倍。
接下来，扩增曲线：随着PCR循环的进行，扩增曲线会呈指数增加。
扩增曲线反映了PCR反应体系中拷贝数的变化。
在扩增曲线的指数增长阶段，荧光信号会迅速增加。
随着PCR循环数增加，荧光信号的增加速率会逐渐减慢。
根据扩增曲线的特征，可以计算出PCR的阈值周期数（Ct值），即荧光信号超过背景噪音的周期数。
Ct值可以用来定量目标DNA序列的拷贝数。
最后，荧光探针：荧光探针是一种含有荧光染料和阻尼染料（quencher）的引物。
引物特异性地结合在扩增产物的靶标序列上。
在引物结合的过程中，荧光信号被抑制。
当引物与靶标序列结合后，PCR反应体系中DNA聚合酶会将DNA链分离，使荧光信号被释放出来。
通过检测释放的荧光信号，可以定量PCR反应体系中目标DNA序列的拷贝数。
1.肿瘤检测：荧光定量PCR可以检测肿瘤相关基因的突变、重排和拷贝数变化。
通过定量目标基因的变化，可以实现对肿瘤的早期诊断和治疗监测。
2.微生物检测：荧光定量PCR可以快速检测致病微生物的存在。
例如，在食品安全领域，可以用荧光定量PCR检测食品中的细菌和病毒污染。
3.分子诊断：荧光定量PCR可以定量检测与疾病相关的遗传变异。
例如，可以通过荧光定量PCR检测与遗传病相关的突变，为临床诊断提供准确的基因检测结果。
4.环境监测：荧光定量PCR可以快速检测环境中的微生物群落的变化。
例如，在水源污染监测中，可以用荧光定量PCR检测水体中的细菌和寄生虫的存在。
总之，荧光定量PCR是一种快速高效的检测技术，可以广泛应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。
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我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。
上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。
Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。
如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。
要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。
能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。
定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。
实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。
一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
一：水解探针法TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。
这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。
但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高.MGB 技术原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针——MGB探针（minor groove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-ODN)，3'端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。
此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm 值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm 值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。
允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。
有实验证明MGB探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变(因为碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大)水解探针之所以称之为水解，主要是因为它利用的是Taq酶的水解作用，使得探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR新扩增产物，此方法检测的是积累荧光。
优点：灵敏，特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。
有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高此外，也有人认为，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出产的Taq酶对于其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影响，酶活性差异也给定量带来了不确定性。
至少，生物通定量PCR技术系列前面介绍的Stratagene 2100万美元专利之争的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探针法了！应用：Taqman技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等方面都有成功的许多例子。
注意：1) 探针长度应在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保证结合的特异性。
2) GC碱基含量在40%-60% ，避免单核苷酸序列的重复。
3)避免与引物发生杂交或重叠。
4)探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm 值至少高出5℃。
另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
另外，在仪器的选择上也要注意，尽量选择具有4色或以上的荧光检测通道的仪器，已保证你的机器的适用性和试剂选择的灵活性。
毕竟技术是在快速发展的。
二：杂交探针法FRE原理：罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针，或者LightCycle探针。
FRET技术探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光基团。
当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。
当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。
FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。
常用的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。
两个单标记探针的长短不影响信号的传递，而探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。
我们前面提到，Taqman水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。
杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。
比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分析出来，这也是Taqman法无法做到的。
另外，由于采用2条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响。
Fret探针法由于需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。
但实际上，Fret探针的设计其实比Taqman 探针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。
Fret探针就不受这个限制。
不管怎么说，多数人还是习惯认为单探针比合成2条探针要简单。
在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时间是1996年）分子信标技术原理：分子信标（Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。
荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30bp（有人认为18-20个bp较好）长，并与目标序列互补，茎一般5-7bp长（GC含量较高），相互配对形成茎的结构。
荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。
在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。
与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。
应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物医学基础和临床研究中。
优点：本底低，特异灵敏缺点：①杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。
②探针合成时标记较复杂延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中Sunrise技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足。
Amplisensor技术是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。
两探针长度不同，其中淬灭物标记探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。
PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。
扩增时该探针－引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。