噬菌体展示
噬菌体展示技术和其应用ppt课件
2024/3/30
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应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
2024/3/30
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
简述噬菌体展示的基本原理和方法
简述噬菌体展示的基本原理和方法噬菌体展示是一种利用噬菌体（即细菌病毒）作为展示载体来展示外源蛋白的方法。
噬菌体是一种寄生在细菌上并以细菌为宿主的病毒，它具有高效的感染能力和高度选择性的感染靶细菌的特性，因此被广泛应用于基因工程、蛋白质工程和生物技术研究领域。
噬菌体展示的基本原理是将目标蛋白的编码基因与噬菌体的外壳蛋白基因相连接，构建成重组噬菌体基因。
在噬菌体感染细菌的过程中，重组噬菌体基因会被细菌细胞内的转录和翻译系统识别并表达出来，从而使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白相连，展示在噬菌体的表面。
噬菌体展示的方法主要有两种：一种是基于基因III的展示系统，另一种是基于基因VIII的展示系统。
基因III是噬菌体表面的主要外壳蛋白，通过将目标蛋白编码基因与基因III基因相连接，并在细菌细胞内进行表达，可以使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白连接在一起。
基因VIII则是噬菌体的次要外壳蛋白，通过将目标蛋白编码基因与基因VIII基因相连接，并在细菌细胞内进行表达，可以使目标蛋白展示在噬菌体的表面。
噬菌体展示的方法在实验室中可以通过以下步骤来进行：首先，将目标蛋白的编码基因与噬菌体的外壳蛋白基因进行连接，构建成重组噬菌体基因；然后，将重组噬菌体基因导入到感染性大肠杆菌等宿主细菌中；接着，通过培养宿主细菌，使重组噬菌体基因在细菌细胞内进行转录和翻译，从而使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白连接在一起；最后，通过离心分离和纯化的方法，获得展示目标蛋白的重组噬菌体。
噬菌体展示的优势在于其高效、高通量和高度选择性的表达特点。
由于噬菌体具有高效的感染能力和短周期的复制时间，可以在短时间内大量表达目标蛋白，并且可以通过筛选和分离的方法选择性地表达和纯化感兴趣的蛋白。
此外，噬菌体展示还可以实现对目标蛋白的定向进化和筛选，使其具有更好的性能和活性。
噬菌体展示在科学研究和应用领域具有广泛的应用价值。
在药物研发领域，噬菌体展示可以用于筛选和鉴定潜在药物靶点，并可以通过定向进化的方法优化药物分子的亲和性和特异性。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术第一篇：噬菌体展示技术介绍噬菌体作为一种针对细菌的病毒，与我们生活息息相关。
除了作为抗生素的发现者，噬菌体还可以被利用于噬菌体展示技术。
这种技术利用噬菌体表面展示的蛋白质，实现对目标蛋白质的快速筛选和鉴定。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、优缺点，以及在生命科学研究和工业生产中的应用。
一、原理噬菌体展示技术是将目的蛋白或肽插入噬菌体表面的一种方法。
噬菌体表面组分主要有三种：1）编码质粒的pIII蛋白质；2）编码细胞毒素E的pVIII蛋白质；3）编码专一结合的pV蛋白质。
它们在噬菌体的组成和结构上有不同的作用。
其中，pIII和pVIII蛋白质被广泛地应用于蛋白质展示，pV 蛋白质则被用于病毒特异性分离。
噬菌体展示技术的基本步骤为：首先，在噬菌体pIII或pVIII蛋白质基因的外侧区域中插入目的蛋白的DNA序列；然后使用这些噬菌体感染大肠杆菌。
噬菌体在感染过程中就会将目的蛋白展示在其表面。
最后，可使用具有亲和力的配体或抗体选择目的蛋白并纯化。
二、优缺点噬菌体展示技术的优点主要集中在以下几个方面：1）大容量：噬菌体可以在感染过程中表达众多的外表面蛋白，其中每个蛋白均可成为一个展示物，针对多种噬菌体展示技术。
2）直接鉴定：在已知多肽的情况下，可以使用特定的抗体直接鉴定噬菌体表面的展示蛋白。
3）高灵敏度：噬菌体展示技术对目标蛋白的识别灵敏，并且可以使用大量病毒颗粒进行检测。
4）高效率：噬菌体展示技术可将展示蛋白直接表达在噬菌体的表面，无需进行分离提纯，从而加快了蛋白纯化过程。
噬菌体展示技术的缺点主要有以下几方面：1）分子大小限制：目前仅适用于直径小于1/3噬菌体直径的蛋白分子。
2）生物安全：组装成噬菌体后，展示蛋白无法及时得到更新，可能会导致噬菌体的生物安全风险。
3）抗原性：由于目的蛋白常常被表达在噬菌体的表面，因此它们可能会被视为异物而引起免疫反应。
三、应用由于噬菌体表面蛋白质的展示，噬菌体展示技术已经被广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
噬菌体展示技术的原理和方法
噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。
噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。
它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。
噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。
展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。
载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。
常用的载体包括M filamentous phage等。
这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。
在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。
这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。
在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。
还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。
在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。
这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。
反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。
克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。
这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。
这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。
噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示筛选抗体技术介绍
探索生物医学中的创新应用
目录
01 噬菌体展示筛选抗 体概述
06 噬菌体展示抗体的 发展前景
02 噬菌体展示技术原 理
03 噬菌体展示抗体筛 选流程
0Hale Waihona Puke 噬菌体展示抗体的 应用案例05 噬菌体展示抗体的 优点与缺点
01 噬菌体展示筛选抗体 概述
噬菌体展示筛选抗体概述
1 噬菌体展示筛选抗体技术介绍
疗效果并降低副作用。
05 噬菌体展示抗体的优 点与缺点
噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术能够快速、 高效地筛选出特异性抗体， 大大缩短了实验周期，提高 了研究效率。
噬菌体展示抗体的局 限性
噬菌体展示技术虽然筛选速 度快，但存在假阳性率高的 问题，需要进一步的验证和 优化。
噬菌体展示筛选抗体技术是一种利用噬菌体表面
噬菌体展示筛选抗体的优势 2 展示特定蛋白质，通过生物淘选方法寻找与目标
噬菌体展示筛选抗体技术具有高度灵活性和多样
抗原特异性结合的抗体的方法。
性，能够快速、高效地筛选到具有高亲和力和特
异性的抗体，为免疫学研究和药物开发提供了重
要工具。 3 噬菌体展示筛选抗体的应用前景
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术具有高度灵 活性和多样性，可以快速、 大量地筛选出特异性强、亲 和力高的抗体，为生物医学 研究和药物开发提供了重要 工具。
噬菌体展示抗体的应 用前景
噬菌体展示抗体技术在肿瘤 治疗、免疫诊断、疫苗研发 等领域具有广泛应用前景， 有望为人类健康事业做出重 要贡献。
谢谢大家
噬菌体展示筛选抗体技术在疾病诊断、治疗和预
防等方面具有广泛的应用前景，包括癌症治疗、
噬菌体展示
噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。
它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。
噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。
通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。
原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。
这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。
插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。
噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。
通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。
应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。
通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。
肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。
通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。
蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。
通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体展示技术的概念
噬菌体（bacteriophage）是一种寄生于细菌的病毒，它可以感染并破坏细菌。
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体来展示外源蛋白或肽的方法，使研究人员能够研究和利用噬菌体的寄生性质，以及利用其表面展示的能力。
噬菌体展示技术的概念包括以下几个方面：
1. 噬菌体结构：噬菌体的结构由头部、尾部和尾纤毛组成。
头部包含基因组，尾部用于附着并注入基因组到宿主细菌中。
噬菌体展示技术通过利用这些结构，使其能够在噬菌体表面展示外源蛋白或肽。
2. 插入式展示：这是一种常见的噬菌体展示技术，其中外源蛋白或肽的基因序列被插入到噬菌体的基因组中，通常是在噬菌体的尾部或头部。
这样，当噬菌体感染宿主细菌时，它会在其表面展示外源蛋白或肽。
3. 表面展示：通过噬菌体的表面展示外源蛋白或肽，研究人员可以利用这些病毒来模拟和研究宿主细菌的亲和性、结合性等特性。
这对于蛋白质工程、药物筛选、疫苗研发等方面具有潜在的应用。
4. 生物材料筛选：利用噬菌体展示技术，研究人员可以将噬菌体库用于生物材料的高通量筛选。
这可以加速对特定蛋白质、肽段或化合物的研究。
5. 疫苗研发：噬菌体展示技术还可应用于疫苗研发。
通过在噬菌体表面展示特定的抗原蛋白，可以激发免疫系统产生特异性抗体，从而产生免疫应答。
总的来说，噬菌体展示技术提供了一种独特的方法，可以利用噬菌体的自然寄生性质，将外源蛋白或肽有效地展示在噬菌体表面，从而用于各种生物学研究和应用领域。
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测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。
正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。
低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。
适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。
然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。
根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。
在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。
由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。
如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。
第一天根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。
每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。
下述方法中给出的量是60×15 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。
但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：2×1011个病毒子。
1. 准备100 μg/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。
如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。
2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 μl）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。
3. 在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4℃轻微震荡，孵育过夜。
平板可在此容器中4℃贮存备用。
第二天4. 挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。
如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。
37℃剧烈震荡培养。
5. 倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。
每板（或孔）加满封阻液，4℃作用至少1 hr。
6. 按5中所述方法除去封阻液。
再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。
每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。
此操作要快以避免板干燥。
7. 用1 ml（微孔板则用100 μl）的TBST缓冲液稀释2×1011的噬菌体（即10 μl的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。
8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。
9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。
10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 μl）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。
一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（~100 μg/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。
室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。
10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。
然后再用150 μl（微量孔则用15 μl）1M Tris-HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。
11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量（~1 μl）洗脱物的滴度。
如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。
（必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。
这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。
37℃剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。
12. 剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37℃剧烈摇动培养4.5 hr。
13. 将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000 rpm离心10 min。
上清液转入另一离心管中，再离心。
14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。
让噬菌体4℃沉淀至少60 min，最好过夜。
第三天15. 4℃10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。
倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。
16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5 min使残余细胞沉淀。
17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。
冰上孵育15-60 min。
4℃离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。
18. 沉淀物重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。
离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。
上清转入新鲜管中。
此即为扩增后的洗脱物。
19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。
4℃贮存。
20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。
第四和第五天21. 计数板上蓝斑数确定滴度。
用这个值来计算相应于2×1011 pfu的加入量。
如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。
22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。
23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。
24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。
第六天25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。
26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。
第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。
其余洗脱物4℃贮存。
27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。
噬菌斑的扩增1. 将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。
每个要鉴定的克隆一管。
一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。
2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。
注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。
3. 37℃摇床培养4.5-5 hrs（不要过长）。
4. 培养物转入微量离心管中，离心30 sec。
上清转入以新鲜管中，再离心。
用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。
长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存。
测序模板的快速纯化(22)1. 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。
2. 加200 μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。
3. 离心10 min，弃上清液。
4. 短暂离心，小心吸去残余上清。
5. 沉淀物彻底重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入250 μl乙醇。
室温温育10 min。
短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
6. 离心10 min，弃上清。
用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
7. 沉淀重悬于30 μl TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA]中。
8. 5 μl的上述模板溶液足够送测序。
用-96 gIII测序引物。