第十五章 基因工程与现代发酵工业

不同的碳源对菌体的生长和外源 基因表达有较大的影响。使用葡萄 糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸 强度相差不大。但使用甘油菌体得 率较大，而使用葡萄糖菌体产生的 副产品较多。葡萄糖对lac启动子有 阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。
在氮源中，酪蛋白水解物 有利于产物的合成与分泌。色 氨酸对trp启动子控制的基因有 影响。 无机磷在许多代谢反应中 是一个效应因子，磷浓度不同， 影响菌体生长。
⒉接种量的影响
接种量是指移入的种子液体积和培 养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发 酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌 龄老化，不利于外源基因表达。
接种量大，可缩短生长延 迟期，菌体迅速繁衍，很快进入 对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快， 代谢物积累过多，反而会抑制后 期菌体的生长。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高 工程菌的生长，利于外源蛋白产物 的形成。
总之,最佳化的工艺是获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、 最周全的废物处理效果、最佳 速度和最低失败率等。
(三)基因工程菌的培养设备
应用发酵罐大规模培养基因 工程菌。它不同于微生物发酵， 微生物发酵目的是为了获得初级 或次级代谢产物，细胞生长并非 主要目标，而基因工程发酵是为 了获得最大量的基因表达产物。
采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提 高活菌产量。
⒌ 诱导时机的影响
对于λPL启动子型的工程菌，使用cI 阻遏蛋白的温度敏感型突变株 （clts857），在28～30 0C下培养时，该 突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL 启动子的转录； 当温度升高42 0C时，该阻遏蛋白失活， 使启动子启动转录，提高目的基因的表 达效率。一般在对数生长期或对数生长 后期升温诱导表达。
五
基因工程菌培养和发酵的主要 障碍及其控制
• 营养源成分及浓度对菌体生长的抑制及 其控制 • 菌体代谢产物－乙酸对工程菌的生长的 抑制及其控制 • 溶解氧的限制及其解决方法 • 质粒稳定性及其控制 • 其它因素（泡沫、CO2等）
1 营养源成分及浓度对菌体生长的抑 制及其控制
• 问题：许多营养成分（包括碳源和氮源），如 果在培养基中的浓度超过某个特定值时由于渗 透压等原因，会抑制菌体的生长。如以下物质 浓度高于其相应值时抑制生长：葡萄糖 （50gL-1）、氨（3gL-1）、铁（1.15gL-1）、 镁（8.7gL-1）、磷（10gL-1）、锌（0.038gL1）。 • 解决方法：高密度培养应从低于临界抑制浓度 开始，并在必要时补加营养物质以维持生长。
在对数生长期，细胞快速繁殖， 直到细胞密度达到109/个为止，这 时菌体数目倍增，对营养和氧需求 量急增，营养和氧成了菌群旺盛代
谢的限制因素。
⒍ pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源 蛋白的高效表达都有影响，所以 应根据工程菌的生长和代谢情况， 对pH进行适当的调节。
如采取两段培养工艺， 培养前期重点是优化工程菌的 生长条件，其最佳pH在6.8～ 7.4左右;培养后期重点是优化 外源蛋白的表达条件,其最佳 pH为6.0～6.5。
基因工程菌生长代谢的特点
菌体的生长通常用比生长速率来 表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳 源控制补料和稀释速率等方法来控制 菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳 定性、减少代谢副产物积累、提高外 源蛋白产率有重要意义。
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比 值是基本恒定的，因而菌体的生 长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变 菌体的能量代谢和小分子前体的 供应，影响生物大分子的合成和 菌体的生长。
通过已分离到的降解性质粒转移或者 将降解工业污染物的基因转移到一些菌 中，用这些微生物降解环境中的一些污 染物达到环保的目的。这些基因工程菌 能够大大提高降解污染有机物的效率。
水解酶基因opd，转移到Strepomyces lividans 中，转化菌株能稳 定水解硫磷，此菌发酵液可用于农药厂废水处理中。
一 基因工程菌的构建
大肠杆菌
大肠杆菌质粒
二 基因工程菌发酵过程
发 酵
工程质粒转化及菌种筛选
一级菌种
二级菌种
菌 种 筛 选
三 基因工程菌的培养与发酵的特点
基因重组菌的培养与发酵的特点:
（1）培养工程的角度:营养源浓度的控制 （碳源、氮源等）、最适生长条件的控 制等； （2）生物学上应考虑:质粒稳定性的控制、 质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效 率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等。
发酵罐的组成有： 发酵罐体、保证高传质作 用的搅拌器、精细的温度控制 和灭菌系统、空气无菌过滤装 置、残留气体处理装置、参数 测量与控制系统、培养液配制 和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件，
培养过程不得污染，保证纯菌培养，
培养及消毒过程不得游离异物，不能 干 扰细菌代谢活动等。
2 菌体代谢产物－乙酸对工程菌的生 长的抑制及其控制
• 问题：乙酸是大肠杆菌代谢产物，其积累抑制 大肠杆菌的生长。大肠杆菌在以下三种情况下 生长容易产生乙酸：一是缺乏氧气，二是高葡 萄糖浓度，三是生长太快。 • 解决方法：a.充分供氧；b.降低碳源浓度，不 断流加碳源，避免菌体过速增长；c.采用甘油 等其它碳源。
工艺要求：外源基因既高效表达， 又有利于产品分离纯化。对发酵影 响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响
⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的 生长速率，又要保持工程菌的稳定性， 使外源基因高效表达。常用的碳源有： 葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖 等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋 白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、 硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维 生素等。
将乙醇生产途径中的一些酶基因（pdc、adh B等）导入到大肠 杆菌等微生物中，可以用半纤维素浆、马铃薯淀粉等原料发酵生产 乙醇。
第二节 基因工程菌的发酵
基因工程技术在生产重组蛋白类药物的生 产上的应用是目前基因工程技术发展最快的一 个领域。近20年来随着基因工程技术的快速发 展，重组工程菌的培养面临着许多新的挑战， 比如质粒稳定性、高密度培养、目的蛋白高效 表达等。所以，工程菌的发酵工艺研究，在基 因工程技术实际应用中成为一个及其关键的环 节。下面以大肠杆菌工程菌的高密度发酵为例 讲述基因工程菌的发酵。
它的浓度增加会导致在合成mRNA 和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动 产生停顿，RNA链延长速度减慢，使 游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控 制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合 酶与PL启动子专一识别反应。
四 基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的 基础条件,如温度、pH、培养基各种 组分、碳氮比，分析表达产物的合 成、积累对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和 控制方案以及顺序。
蛋白酶
脂肪酶
乳酪生产啤酒去浊，浓缩鱼胨，制酱油
鱼片脱脂，毛皮脱脂等
淀粉酶
纤维素、半纤维素酶 糖化酶 果胶酶 植酸酶 葡萄糖异构酶
麦芽糖生产．醇生产等
乙醇生产，植物抽提物澄清和将纤维素转化为糖 酶法制糖 用于葡萄酒和果汁的澄清及减少其粘度 可将饲料中的植酸盐降解成无机磷类物质 制造高果糖浆
三、基因工程在环保工业中的应用
(一)菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体 生长所需能量大于菌体有氧代谢提 供的能量时，菌体会产生乙酸，导 致培养基的pH值下降，从而影响菌 体的生长。适当提高pH，可减少乙 酸的抑制作用
分批培养中选择不同的碳源，连
续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
干扰素、促红细胞生成素（EPO）、白细胞介素等等
应器
3 基因治疗方法治疗疾病：
血友病的基因治疗（缺陷凝血因子VIII ）
4 中药现代化中基因工程的应用：
水蛭素Ⅲ(HV3)基因原核表达（抗血凝酶）
二、基因工程在食品工业中的应用
1 酶制剂方面的应用
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖化酶和植酸酶等酶的生产
《发酵工程》
第 十五 章
基因工程与发酵工业
主讲教师：双 宝
东北农业大学生命科学学院
第一节 基因工程在现代工业中的应用
• • • • 在医药工业中的应用 在食品工业中的应用 环保工业中的应用 化学与能源工业中的应用
基因工程应用的技术路线
一、基因工程在医药工业中的应用
1 利用微生物生产蛋白类药物 ：
四、基因工程在化学与能源工业中的应用
1 传统化学工业中有机物发酵菌中的改造：
（1）基因工程技术改造过的Clostriodium acetobutylicum ATCC824可 用于丁醇生产； （2）生产丙酮、醋酸等的菌种转移相关酶的基因可以可以改善其转 化效率。
2 用基因工程技术生产酒精等石油替代品：
质粒存在对菌体代谢的影响： 中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中 与前体合成有关的酶增加，这些酶的 基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并 合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延申过程减少 转录。