第二章基因工程制药part2
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《基因工程制药》PPT课件
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21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
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22
第一个合成蛋白质的国家。
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10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
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8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
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9
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
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11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
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12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
生物技术制药：2-基因工程制药-2
• 盐析后—疏水性层析
3.根据分离纯化的工艺要求来选择 ➢ 基本原则：
具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性 尽可能减少组成工艺的步骤 分离纯化工艺所用的时间尽可能短 工艺和技术必须高效
（四）基因重组蛋白的分析和鉴定
➢ 1. 蛋白质含量的测定
紫外（UV)吸收光谱
基本原理：因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的 这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶 液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
错流方式可有效降低膜 污染及防止浓差极化现 象，系统连续操作。
① 渗透和透析
➢ 渗透是一个扩散过程， 利用膜的两侧渗透压差 使溶剂产生流动。
➢ 透析是利用膜两侧的浓 度差为驱动力，从溶液 中分离出小分子物质的 过程。
如：医疗上用于处理肾 功能衰竭病人。
透析
② 反渗透、超滤和微滤
从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透；分 离溶液中微粒和大分子的膜分离操作为超滤；使 不溶物浓缩过滤的操作为微滤。
➢ 它是利用蛋白质等电点的差异，来实现不同蛋白 质的分离和纯化。
洗脱 洗脱
离子交换
2. 亲和层析法
➢ 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间 具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特 殊层析技术。
➢ 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗 体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞 争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维 生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植 物凝集素等。
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
3.根据分离纯化的工艺要求来选择 ➢ 基本原则：
具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性 尽可能减少组成工艺的步骤 分离纯化工艺所用的时间尽可能短 工艺和技术必须高效
（四）基因重组蛋白的分析和鉴定
➢ 1. 蛋白质含量的测定
紫外（UV)吸收光谱
基本原理：因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的 这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶 液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
错流方式可有效降低膜 污染及防止浓差极化现 象，系统连续操作。
① 渗透和透析
➢ 渗透是一个扩散过程， 利用膜的两侧渗透压差 使溶剂产生流动。
➢ 透析是利用膜两侧的浓 度差为驱动力，从溶液 中分离出小分子物质的 过程。
如：医疗上用于处理肾 功能衰竭病人。
透析
② 反渗透、超滤和微滤
从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透；分 离溶液中微粒和大分子的膜分离操作为超滤；使 不溶物浓缩过滤的操作为微滤。
➢ 它是利用蛋白质等电点的差异，来实现不同蛋白 质的分离和纯化。
洗脱 洗脱
离子交换
2. 亲和层析法
➢ 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间 具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特 殊层析技术。
➢ 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗 体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞 争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维 生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植 物凝集素等。
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
第二章基因工程制药新版2
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
1、细菌质粒
（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒
（1）质粒的定义
质粒载体(plasmid)
存在于天然细菌体内 的一种独立于细菌 染色体之外的双链 环状DNA，具有独 立复制的能力，常 带有细菌的抗药基 因。也存在于某些 真核细胞（酵母的 2μ环状质粒）
（2）质粒的特性
独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
（3）质粒的分类
F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起 转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。
R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗 性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另 一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。
（A2）、SV40病毒DNA的基因 组
（A3）、SV40病毒DNA载体的 构建
（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法
[G]、腺病毒
（G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特
点
3、λ噬菌体DNA
（1） λ噬菌体DNA的特性 （2） λ噬菌体DNA的改造 （3） λ噬菌体DNA的体外包装 （4） λ噬菌体载体的构建 （5） λ噬菌体载体的使用 （6） λ噬菌体载体的优点
基因工程制药技术 基因工程常用工具
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体（1）质粒DNA存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子具有自我复制功能（松弛、严紧）带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点
Part2 基因工程操作工具
二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比
连接酶
底物
辅助因子和激活因子
温度
巯基试剂
黏性末端
平末端
DNA-RNA杂合体
RNA-RNA杂合体
大肠杆菌DNA连接酶
可行
可行
不行
不行
NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）
黏性末端：10~15 ℃补平缺口：37 ℃
无
T4DNA连接酶
生化制药工艺
项目五 基因工程制药
1
基因工程的概念
2
基因工程操作工具
3
基因工程操作流程
目ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
CONTENTS
基因工程常用工具
02
Part2 基因工程操作工具
一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶 “分子缝合针” ---- DNA连接酶 “分子运输车” ----载体
Part2 基因工程操作工具
二、限制性内切酶1、工具酶
工 具 酶
功 能
三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体（1）质粒DNA存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子具有自我复制功能（松弛、严紧）带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点
Part2 基因工程操作工具
二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比
连接酶
底物
辅助因子和激活因子
温度
巯基试剂
黏性末端
平末端
DNA-RNA杂合体
RNA-RNA杂合体
大肠杆菌DNA连接酶
可行
可行
不行
不行
NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）
黏性末端：10~15 ℃补平缺口：37 ℃
无
T4DNA连接酶
生化制药工艺
项目五 基因工程制药
1
基因工程的概念
2
基因工程操作工具
3
基因工程操作流程
目ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
CONTENTS
基因工程常用工具
02
Part2 基因工程操作工具
一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶 “分子缝合针” ---- DNA连接酶 “分子运输车” ----载体
Part2 基因工程操作工具
二、限制性内切酶1、工具酶
工 具 酶
功 能
01基因制药-基因工程制药(2)
二、
去除附加的甲硫氨酸有两种方法：
（1）在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 （2）在分离纯化后在体外用外肽酶处理。 但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类 型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。
三、酵母中的基因表达
• 酵母表达系统是随着酵母质粒和酵母转化技术的建
立而逐步发展起来的，其与其它表达系统一样，包
成酶系基因，也可以是利用抗性基因作为选择性标记。克隆载体
既可以在细菌中进行质粒复制和表型选择，又能在酵母中进行质 粒复制和表型选择。
（3）表达载体
• 将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当 位点后，就构成了酵母菌的表达载体。 • 酵母菌的表达载体有两类：普通表达载体和精确表达载体， 前者只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组
应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。
（2）丝状真菌
• 近年来，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统
• 特点：
有很强的蛋白分泌能力； 能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其 糖基化方式与高等真核生物相似； 丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发
酵和后处理工艺。
（3）哺乳动物细胞
（3）外源蛋白的糖基化
• 外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖苷键（天冬酰胺连接）和 O-糖苷键（丝氨酸或苏氨酸连接）的两种不同的糖基化，与 哺乳动物中发生的糖基化相同。外源蛋白经酿酒酵母合成、 氨基末端修饰、二硫键形成、蛋白质折叠和糖基化后，可靠
有效地以活性型分泌到培养基中，而且某些蛋白质糖基化后
更加稳定，便于分离精制。
β-半乳糖 β-半乳糖 β-半乳糖 苷透性 苷转乙酰 苷酶 酶 基酶 乳糖代谢诱导酶
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生物技术制药：2-基因工程制药-2
下相 杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 目的蛋白
白 流 程
第三步两相萃取
静置分层 +盐
下相 目的蛋白
上相 杂蛋白、 PEG、色素
（二）基因重组蛋白的主要纯化技术
➢ 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱 技术分为：
Ion exchange chromatography (IEC) Gel filtration chromatography (GFC) Hydrophobic interaction chromatography (HIC) Affinity chromatography (AC)
二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定 (自学）
基因重组蛋白的特点
➢ (1) 目的产物在初始原料中的含量较低; ➢ (2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的
产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、 无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分 离纯化影响很大；
➢ (3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张 力等十分敏感，容易是其失活、变性；
① 等电点沉淀法
➢ 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不 同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可 进行分离。
✓ 如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性 蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。
② 盐析法
定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度 的增加而升高的这种现象称为盐溶(salting in), 但 当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析 (salting out)
➢ 几种盐的盐析能力的排列次序：
• 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
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外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
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外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
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第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•
目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培
养
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•
利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条
件
• 下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白
基
• 因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。
• 从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。
•
用基因敲出技术缺失大肠杆菌的磷酸乙酰酶基因
• pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合途
• 慢，使高密度发酵比较困难。
• 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
• 生物比活力降低，甚至没有活性。
• 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
• 目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分
离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣 •包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中， •大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白质因子的量不能满足需要， •无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达 •与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧化 •蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。
•研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要
•不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要多个蛋白
•因子共表达才能达到预期的目标。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键形成和正确折叠
•大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA 和 DsbB二个 •蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。
径
• 被阻断。
•
改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿
酒 第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建蛋白质水解酶活力低的工程化宿主菌
•
对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随后
发
• 酵后期各种蛋白酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的
作
• 用而被降解。为了使对蛋白酶比较敏感的目标蛋白也能获
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
第二章基因工程制药part2
•
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途
的
• 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主
要
• 表现为：
• 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
• 一般比较低，不能满足大规模制备的需要。
• 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立
•主要通过三条途径是目标蛋白呈现在菌体表面： 把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外区 把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构 这二种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的 外源序列，因为较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不 能形成原来的三维结构，影响它转运过程和在膜上的定位。 在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基 因 这种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小， 其序列可在50到500氨基酸残基长度范围内。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特 征和特点，注意引入翻译增强子序列 • 能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为 翻译增强子。 •
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
•表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
第二章基因工程制药 part2
2020/12/10
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
•在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 •由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。 • • 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
•共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）
PDI 能互补dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可
以受到谷胱甘肽的调节。
PDI 具有的二硫键异构，交换和功能有效地弥补了DsbA
和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
• 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。 •
比例。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•降低蛋白质合成的速率，从而增加正确折叠重组蛋白质 从phoA基因合成速度低的突变株中发现其分泌在周 质空间的phoA 的产物-----碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显 著增加，由于只有构象正确的酶原才能被大肠杆菌蛋白转 运系统识别和分泌，这一结果表明了目标蛋白合成的速率 能对其构象形成正确与否产生影响。
•现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： •编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG •编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA •编码 Cys 的密码子 UGU、UGC •编码 Gly 的密码子 GGA、GGG •编码 Leu 的密码子 CUA、CUC •编码 IIe 的密码子 AUA •编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC •编码 Thr 的密码子 ACA
第二章基因工程制药part2
•提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
得
• 较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活性低的工程化宿
主
• 菌。
• rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA聚合酶的r32 亚基，r32
亚
• 基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力第有二章正基因调工程控制药作par用t2 。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
• 构建各种表达载 体
•建立新的表达系统 •目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存 •在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括： • 重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌 • 菌体表面表达技术及其应用 • 重组蛋白质修饰加工研究
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•
目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培
养
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•
利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条
件
• 下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白
基
• 因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。
• 从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。
•
用基因敲出技术缺失大肠杆菌的磷酸乙酰酶基因
• pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合途
• 慢，使高密度发酵比较困难。
• 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
• 生物比活力降低，甚至没有活性。
• 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
• 目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分
离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣 •包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中， •大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白质因子的量不能满足需要， •无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达 •与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧化 •蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。
•研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要
•不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要多个蛋白
•因子共表达才能达到预期的目标。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键形成和正确折叠
•大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA 和 DsbB二个 •蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。
径
• 被阻断。
•
改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿
酒 第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建蛋白质水解酶活力低的工程化宿主菌
•
对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随后
发
• 酵后期各种蛋白酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的
作
• 用而被降解。为了使对蛋白酶比较敏感的目标蛋白也能获
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
第二章基因工程制药part2
•
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途
的
• 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主
要
• 表现为：
• 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
• 一般比较低，不能满足大规模制备的需要。
• 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立
•主要通过三条途径是目标蛋白呈现在菌体表面： 把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外区 把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构 这二种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的 外源序列，因为较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不 能形成原来的三维结构，影响它转运过程和在膜上的定位。 在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基 因 这种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小， 其序列可在50到500氨基酸残基长度范围内。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特 征和特点，注意引入翻译增强子序列 • 能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为 翻译增强子。 •
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
•表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
第二章基因工程制药 part2
2020/12/10
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
•在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 •由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。 • • 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
•共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）
PDI 能互补dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可
以受到谷胱甘肽的调节。
PDI 具有的二硫键异构，交换和功能有效地弥补了DsbA
和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
• 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。 •
比例。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•降低蛋白质合成的速率，从而增加正确折叠重组蛋白质 从phoA基因合成速度低的突变株中发现其分泌在周 质空间的phoA 的产物-----碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显 著增加，由于只有构象正确的酶原才能被大肠杆菌蛋白转 运系统识别和分泌，这一结果表明了目标蛋白合成的速率 能对其构象形成正确与否产生影响。
•现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： •编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG •编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA •编码 Cys 的密码子 UGU、UGC •编码 Gly 的密码子 GGA、GGG •编码 Leu 的密码子 CUA、CUC •编码 IIe 的密码子 AUA •编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC •编码 Thr 的密码子 ACA
第二章基因工程制药part2
•提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
得
• 较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活性低的工程化宿
主
• 菌。
• rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA聚合酶的r32 亚基，r32
亚
• 基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力第有二章正基因调工程控制药作par用t2 。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
• 构建各种表达载 体
•建立新的表达系统 •目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存 •在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括： • 重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌 • 菌体表面表达技术及其应用 • 重组蛋白质修饰加工研究
第二章基因工程制药part2