基因工程制药工艺
生物基因工程技术在制药中的应用
生物基因工程技术在制药中的应用随着科学技术的不断发展和进步，人们在很多领域都开始应用生物基因工程技术。
其中，制药领域也是其中之一。
生物基因工程技术在制药中的应用，不仅能够提高药品的疗效和质量，还可以减少药品的副作用和生产成本，可以说是现代制药的重要推动力之一。
1. 生物基因工程技术简介生物基因工程技术是一种利用生物技术手段来改变生物体的遗传信息的技术。
它主要包括基因克隆、基因组测序、基因编辑和基因组学等方面。
通过这些技术手段，可以让生物产生一些具有特殊功能的蛋白质，从而达到治疗某些疾病的效果。
2. 生物基因工程技术在制药中的应用2.1 生物基因工程技术在药物制剂中的应用生物基因工程技术在药物制剂中的应用得到了越来越广泛的重视。
在制药过程中，生物基因工程技术可以通过改造药物分子的结构或者增加药物的生物活性来提高药物的疗效。
同时，通过这种技术手段，还可以减少药物的副作用和生产成本，提高药物的安全性和可靠性。
2.2 生物基因工程技术在药物生产中的应用生物基因工程技术在药物生产中的应用也得到了广泛的应用。
在过去的制药过程中，通常采用动物或植物细胞进行药物的生产。
但是，这种方法生产的药物效率低、质量不稳定，而且易受到环境因素的影响。
而使用生物基因工程技术，就可以通过改变特定基因的表达或者重组某些蛋白质来生产特定药物分子，这种方法生产的药物效率高、质量稳定，而且可以避免重金属、病毒等污染物质的产生，非常安全可靠。
2.3 生物基因工程技术在药物的研究开发中的应用在药物的研究开发过程中，生物基因工程技术也可以发挥重要作用。
例如，使用基因编辑技术对某些致病基因进行编辑，可以开发出更具针对性的治疗药物，以此来实现更加精确的治疗效果。
此外，通过对人类基因组的研究，也可以找到一些新的治疗靶点，并根据这些靶点设计出更有效的治疗药物。
3. 生物基因技术应用的优势和不足3.1 生物基因技术应用的优势生物基因技术应用在制药中，可以提高药物的疗效、降低药物的副作用和制造成本，同时可以避免污染物质的产生，从而保证药物的安全性。
基因工程制药工艺
YIp酵母整合载体：选择标记和MCS，无自主复制序
列，有整合序列。同源重组整合到酵母染色体，随同染色 体一起复制和遗传。
YCp酵母着丝粒载体：着丝粒序列和自主复制序列。
可自主复制，拷母复制载体：酵母基因组DNA复制序列，可独
载体：安全、无毒 营养缺陷选择外来质粒 培养条件简单，大规模培养技术成熟 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力 缺点： 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用
4、应用
1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表 达人干扰素 激素类：67种人胰岛素及1种突变体，尿酸 水解酶和水蛭素 细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 多肽类：高血糖素 2种乙肝疫苗等
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@ 山东农业大学生命科学学院微生物系
第六章 基因工程制药工艺
6.1 基因工程制药微生物表达系统 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：实验室内完成
生长繁殖迅速，倍增期约2 h
酿酒酵母有17条染色体 1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚 基因组：120.68 Mbp，5887个ORF，编码约 6000个基因
表达载体—穿梭载体
含有复制起始序列或整合序列、选择标记 以及由启动子、终止子和信号肽序列构成 的表达盒序列。 四种类型
YIp酵母整合载体 YCp酵母着丝粒载体 YRp酵母复制载体 YEp酵母附加载体
3、质粒载体
简述基因工程制药的基本流程
简述基因工程制药的基本流程基因工程制药是通过人工改造和调整生物体的基因来生产更有效、更安全的药物。
它的基本流程包括以下几个关键步骤。
1. 目标基因的筛选：在基因工程制药的过程中，首先需要确定目标基因。
目标基因是指具有治疗或预防特定疾病能力的基因。
研究人员通过分析遗传病或其他需要治疗的疾病的相关机制，找到与之相关的基因。
2. 基因克隆：在筛选目标基因后，研究人员需要对其进行基因克隆。
基因克隆是指将目标基因从其所在的生物体中分离出来，并通过PCR（聚合酶链式反应）等方法进行复制，形成多个完全相同的基因。
3. 基因的调整与修改：在基因工程制药中，研究人员还需要对目标基因进行调整和修改，以增强其表达或改变其特定性。
调整和修改的方法包括点突变、插入、删除或拼接等，以获得更理想的基因序列。
4. 载体构建：基因工程制药中常用的方法是将目标基因插入到载体中，通过载体帮助基因进入到目标生物体中并进行表达。
载体通常是一段DNA序列，包含促进基因表达和复制的区域。
在构建载体时，研究人员将目标基因与载体的DNA序列进行连接。
5. 重组表达：完成载体构建后，研究人员将其导入到宿主细胞中，并通过转染等方式使其表达。
在宿主细胞内，目标基因会被转录成mRNA，并通过翻译合成蛋白质。
6. 蛋白质纯化和药物制备：蛋白质是常见的生物制药产品，所以在基因工程制药中，研究人员需要对目标蛋白质进行纯化和制备。
纯化的目的是去除其他无关的蛋白质和杂质，使得产生的药物更纯净、更安全。
7. 药物测试和临床实验：基因工程制药生产的药物需要进行一系列的测试和临床实验，以确保其药效和安全性。
这些测试包括药理学、毒理学和临床试验等，通过这些测试可以评估药物的活性、剂量和不良反应等。
参考内容：[1] Rodin, A. S., & Antonova, O. V. (2021). Basic principles of genetic engineering for the production of pharmaceuticals [J]. Tomsk State University Journal of Biology, (4), 285-301.[2] Thomas, S., Sheela, S., & Skariah, K. (2011). Basic concepts in molecular biology related to genes, heredity, and genetic engineering–Review[J]. Indian journal of dental research: official publication of Indian Society for Dental Research, 22(5), 683. [3] Rao, P. A., Prudhvi, K. L., & Padmanaban, G. (2021). Principles and practice in genetic engineering: genome editing and its application in human therapeutics [J]. Journal of Advanced Research, 28, 43-56.[4] Sprouffske, K., Wagner, J. B., Weaver, L. T., & Adams, W. W. (2019). Genetic engineering as a tool for controlling infectious diseases: A guide [J]. Journal of infectious diseases, 219(12), 1871-1880.。
基因工程制药的基本过程
基因工程制药的基本过程
1.挑选目标基因：首先，需要从目标生物体的染色体中选出需
要改变或增加的基因。
这个基因可能与药物制备过程中的蛋白质结构或生物反应有关。
2.克隆基因：将目标基因从生物体中提取出来，使用PCR技
术扩增并纯化。
然后将其插入到载体DNA中，形成重组DNA。
3.转化细胞：重组DNA必须被转移到生产大量蛋白的细胞中。
这个过程称为转化，它可以通过多个方法实现，如电化或化学转化。
4.筛选、培养转化细胞：转化后的细胞需要筛选和培养，以找
到涌现出目标蛋白的那些转化细胞。
5.表达目标蛋白：在培养细胞中，重组基因被激活并转录成mRNA分子，然后翻译成目标蛋白。
这个过程通常需要添加
诸如摇动培养、温度调节以及细胞培养基的特殊条件。
6.分离目标蛋白：蛋白质表达后，进一步需要通过纯化和分离
方法来获取足够纯净和高质量的目标蛋白。
7.制药：最后，这些蛋白质将被用于药物研发，包括临床试验、药物注册以及与制药公司和医疗保健专业人士合作推广这些药物。
基因工程制药
第三章基因工程制药第一节：基因工程制药基本环节基因工程技术六个基本过程：分离→酶切→连接→转化→筛选→验证。
（一）基因工程中常用的工具酶：ⅰ：核酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶，简称内切酶。
主要存在于原核微生物中。
（1）限制和修饰系统：原核微生物中存在限制性内切酶及甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。
而甲基化酶具有宿主专一性，可识别宿主双链DNA分子的特定序列进行甲基化修饰，而不修饰外源性DNA分子，从而避免了限制酶对宿主DNA的降解。
（2）限制性内切酶的分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性内切酶识别和切割产物是特异性的。
（3）Ⅱ型核酸限制性内切酶：1．酶切方式有两种：①断裂位置交错，形成粘性末端，又可分为从5′粘性末端和3′粘性末端；②对称轴处断裂形成平头末端。
2．同裂酶：是指来源不同，识别序列相同的酶，其切割位点同，产生平头或粘性末端。
3．同尾酶：来源和识别序列都不同，但切割后产生相同的粘性末端的酶。
4．限制性内切酶产生的末端的连接方式有三种：①匹配粘性末端的连接②平端连接③不匹配粘性末端的连接（有两种：67）5．限制性内切酶反应的影响因素：DNA的纯度、反应速度、反应体系的缓冲液、酶量、体积、时间、DNA甲基化程度、DNA的分子构型等。
ⅱ：DNA连接酶：是指催化两条分别具有5′-磷酰基末端与3′-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。
目前使用的DNA连接酶:T4噬菌体DNA 连接酶、大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶。
特点1．T4-连接酶：能够连接含粘性末端或平头末端连接的DNA片段或双链DNA 的切口。
连接反应中 ATP+作能源辅助因子。
2．大肠杆菌：只能连接粘性末端DNA片段或双链DNA的切口，不能连接平头末端DNA片段。
在连接反应中用NAD+作能源辅助因子。
ⅲ：聚合酶：（68）（二）载体：概念：（1）载体：是指凡来源于质粒或噬菌体的ＤＮＡ分子，可以供插入或克隆目的基因ＤＮＡ并具有运载外源ＤＮＡ导入宿主细胞能力的片段。
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段，通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术，基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术，将DNA序列插入到细胞内，使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质，从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域，具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因，可以是已知的治疗目标基因，也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平，需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中，宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养，加入培养基和营养成分，进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大，通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来，使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术，如超滤、离子交换和透析等，得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中，如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
基因工程制药中常用的上、下游技术
• HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK) • Myc-tag (EQKLISEEDL)
和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍
和 Plac 的 11 倍。启动子的强弱程度还与所控外源 基因的性质密切相关。
优化转录调控元件
双启动子表达载体
• 为提高转录活性，增加外源基因的 表达量有时将两个启动子串联到一起。 • 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 • 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型表达的优缺点
• 优点：
• 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的 生长和代谢影响小 • 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 • 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化
• 缺点：
• 必须复性
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
分泌型表达
• 分泌型表达的特点： • 在 N 端加上能够跨膜的信号肽序列。这对 重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是 逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中 的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总 蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的 重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中 的重组蛋白也可能形成包涵体。
外源基因染色体定位整合原理
•
根据DNA同源交换原理，在外源 基因两侧各组合一段与染色体特定 部位完全相同的同源序列。外源基 因越长同源序列也需越长。
外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法
简述基因工程制药的基本过程
简述基因工程制药的基本过程
基因工程制药是一种利用基因工程技术生产药物的方法。
它通过对细胞或微生物进行基因修饰，使其能够生产出人类需要的药物。
该过程包括以下几个步骤：
一、筛选目标基因
首先需要确定所需药物的基因序列，可以通过文献检索或已知的基因库中找到。
然后需要进行筛选和确认，以确定最适合生产所需药物的基因。
二、克隆目标基因
将筛选出来的目标基因进行克隆，并将其插入到表达载体中。
表达载体是一种能够在宿主细胞内稳定存在和复制的DNA分子，可用于转移外源DNA序列到宿主细胞中。
三、转染宿主细胞
将表达载体带有目标基因插入到适当的宿主细胞中，使其成为表达载体和目标基因共同作用下生产所需药物的工厂。
四、优化表达条件
为了提高药物产量和纯度，需要对培养条件进行优化。
这包括培养温度、培养时间、培养介质等方面。
五、提取纯化药物
当宿主细胞生产出所需药物后，需要对其进行提取和纯化。
这通常包
括离心、过滤、层析等步骤，以获得高纯度的药物。
六、药物质量控制
最后需要对生产出的药物进行质量控制。
这包括对药物的纯度、活性、稳定性等方面进行检测，以确保药物的安全和有效性。
综上所述，基因工程制药是一种利用基因工程技术生产药物的方法。
该过程包括筛选目标基因、克隆目标基因、转染宿主细胞、优化表达
条件、提取纯化药物和药物质量控制等步骤。
通过这些步骤可以生产
出高效安全的生物制剂，为人类健康事业做出了巨大贡献。
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基因工程技术是将重组对象的目的基因插 入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工 程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合， 并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技 术。
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基因工程基本过程
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能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生 长繁殖迅速，倍增期约2小时。
酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因 组测序，遗传背景已相当清楚。
基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约 6000个基因。
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3 优点与不足
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3.1 基因工程制药微生物表达系统
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表达宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。
基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。
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3 质粒载体
复制起始点 选择标记 多克隆位点
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质粒类型
严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101；
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；
可溶性蛋白质：存在于细胞质；
周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶 性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端 附加蛋氨酸；
胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外 的培养液中。
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5 优点和不足
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
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Байду номын сангаас
第3章 基因工程制药工艺
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本章内容
3.1 基因工程概述 3.2 基因工程制药微生物表达系统 3.3 基因工程大肠杆菌的构建技术 3.4 基因工程菌的发酵培养与控制 3.5 重组人干扰素生产工艺
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概述
20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医 药科学领域。1982年第一个基因工程产品--人 胰岛素在美国问世。
多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）
激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种 PEG化)
细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干 扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、 白介素-11、白介素-1拮抗剂
溶栓酶类：rPA
白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗） 等。
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆 ⒉构建DNA重组体 ⒊DNA重组体转入宿主菌 ⒋构建工程菌 ⒌工程菌发酵 ⒍表达产物的分离纯化 ⒎产品的检验等
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目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反 转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定
松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；
克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因； 测序质粒：用于基因测序； 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合； 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在； 表达质粒：能表达基因产物
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4 产物表达形式
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基因工程菌：微生物为操作对象，通过基 因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制 表达自身基因的工程生物体。 宿主细胞分为两大类：
第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽 胞杆菌、链霉菌等；
第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、 哺乳动物细胞等。
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一 大肠杆菌表达系统
1 大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
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2 生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无 机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高 达70％），培养周期短，抗污染能力强。
不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白 表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内 毒素，具有抗原性，产生热源。
N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
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6 应用
大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。
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二 酵母表达系统
1 形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。
繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。
菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
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2 生长与遗传特征
孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单 倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞， 进行芽殖。
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二、化学合成法
较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成 法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白 质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同 部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形 成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按 正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用 连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制 ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡 核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序 推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全 一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。