反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
成也萧何，败也萧何？！——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
更换。
仪器管路液体泄漏是导致系统压力不稳定的最
常见情况。 漏液严重时,仪器自身会发出系统压力
过低的警报。 轻微泄漏则可用干燥的餐巾纸擦拭管
路外部,观察纸巾是否被渗入液体进行判断。 泄漏
孔璐璐,等:高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
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可能由管路松动或管路损坏引起,对于前者,重新拧
1. 1. 1 样品前处理不当
样品前处理不当可能会产生鬼峰,一般源于两
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个途径:一是所用试剂被污染;二是测试容器不干
净。 鉴别起来比较简单:使用试剂稀释样品,如果待
测样品出峰明显减小而鬼峰变化不大,则鬼峰源自
试剂污染。 如果洁净容器后重新检测鬼峰消失,则
鬼峰源自容器的污染。
1. 1. 2 流动相污染
的空气。 这种情况可预先将流动相进行超声脱气处
每次补充流动相时以直接补给的方式,没有对贮液
理,然后再装入储液瓶中待用。 二是由于水相和有
瓶进行清洗更换,富集的污染物就会进入到仪器流
机相的物理化学性质存在差异,两者在相互混合时,
路中产生鬼峰。
增加了空气在两种流动相中的溶解度。 对于这种情
上述问题的解决方法是更换流动相,即使用干净
样品的相溶性,如没有特殊原因,一般选择流动相作
留以及色谱柱和仪器管路中污染物的富集。
为待测组分的溶剂,以降低由于待测样品在流动相
在不改变测试条件情况下,如果鬼峰每次有规
中溶解性差引入的空气量。
律地出现在色谱图的相同位置,则污染很可能来自
液相色谱仪采用动态混合器和静态混合器将不
于自动进样器端。 这时可将自动进样针和针座拆
Key words: high performance liquid chromatography; common problems; influence factors;
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。
高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。
液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。
1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。
研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。
液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。
当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。
各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。
上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。
既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
制备型液相使用
内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210nm&254 nm下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法(2006121)
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法作者：陈莲，高…文章来源：饲料工业点击数：630 更新时间：2005-10-11 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是近30年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。
它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离方面更能充分发挥它的特长，为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。
液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题，如果使用人员了解常见问题及其成因和相关的解决方法，能做到早预防、勤维护，会使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
1 液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成（如图1所示）。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。
2 常见问题及解决方法2．1 针对柱压问题（表1）柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。
压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。
值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。
首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。
2．2 针对保留时间漂移的问题[2，3] （表2）保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。
它的产生与很多原因有关。
2．3 针对异常色谱峰问题[2-4]异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。
高效液相色谱使用常见问题解决方法
高效液相色谱使用常见问题症状：(一)保留时间变化可能的原因 : 解决方法1.柱温变化: 柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染 : 每天冲洗柱5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命 : 采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因 : 解决方法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速2.样品超载 : 降低样品量3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加 : 柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失 : 同前(二)34.流动相组成变化 : 同前(二)45.温度降低 : 同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物 : 处理样品3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大 : 同(四)12.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载 : 进小浓度小体积样品液相色谱常见问题及处理方法HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法
８ ２００５．０５高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法陈莲 高洪 肖啸（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 ６５０２０１）高效液相色谱（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＰＬＣ）技术是近３０年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。
它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，手段灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离、食品卫生安全检验等方面更能充分发挥它的特长，为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。
液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题，如果使用人员了解了常见问题及其成因和相关解决方法，能做到早预防勤维护，使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
１ 液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，色谱柱、泵和检测器是核心部件同时也是容易出事故的主要部件。
２ 常见问题及解决方法２．１ 针对柱压问题柱压变化是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的指标，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效高低、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在５０ＰＳＩ（针对Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪）之间。
压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动种类相关。
值得注意的是在使用梯度洗脱进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
一般而言，柱压变化最先考虑的是柱子，在排除柱子因素后再考虑其它因素。
在实际应用中常见柱压问题可从以下几个方面来考虑（见表１）。
２．２ 针对保留时间漂移的问题保留时间的改变是很多液相色谱仪使用者常碰到的问题，包括了保留时间的延长或缩短。
它的产生与很多因素有关，可从以下方面进行考虑（见表２）。
图１ 液相色谱仪工作系统及流程２００５．０５ ９更换新的色谱柱。
高效液相色谱实验教学存在的问题、原因及对策
用脱节 的问题
从 用 工 企业 反 馈 的信息 来 看 ， 大 部分 学 过高 效 液相 色谱 实验课 程 的毕 业 生 ， 对 于 色谱 进 样 针 的使
用、 进样操作、 软件使用 、 数据分析掌握相对较好 ， 但
基金项 目 ： 西华大学重点科研基金项 目（ Ｚ １ ２ ２ ３ ３ ２ ２ ） ； 西华大学校级教改项 目。
２ ６
第３ ０卷第 ３期
高效液相 色谱 实验教 学存在 的问题、 原 因及 时策
２ ０ １ ３年 ９月
题 。很 多 同学 在实 际使 用 过 程 中 ， 往 往 按 照 这 样 的 错 误操 作 执行 ： 当分析样 品色谱 峰 出来 完毕后 ， 就直 接停 泵 、 关 软件 、 关 电源 。这 样 的错 误 操作 过程 缺少
一高效液相色谱实验教学中存在学与用脱节的问题从用工企业反馈的信息来看大部分学过高效液相色谱实验课程的毕业生对于色谱进样针的使用进样操作软件使用数据分析掌握相对较好但是对于一些核心操作过程特别是涉及仪器保护方面的操作技能掌握很差有些知识点甚至根本没有掌握到存在以下学与用脱节的问题
第３ ０卷 第 ３期
处理 操作 过程 。 ２ ．不知 道 如何 更 换 液 相 色谱 柱 。有 的 同 学 不
发展 出了制备 型高 效 液 相 色谱 ， 大 大丰 富 了分离 制
备手 段 。但是 ， “ 仪 器分 析 实验 ” 课 程所 涉 及 大型
仪器 由于价格 昂 贵 ， 实验 室仪 器 的数量有 限 ， 实践教 学 时很难 达到 每人 一 台仪 器 ， 高效液 相色谱实验教学存在 的 问题 、 原 因及对策 术
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成也萧何，败也萧何？！——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
最后是通过结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。
若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。
虽困难，到从合成的角度来讲，也容易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。
同时，也可以回到出发点——了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。
回收纯化的物质——万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。
可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。
冷冻干燥也可以派上用场。
具体情况具体分析吧。
需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。
具体实例：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。
这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC上。
制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯水中溶解度都不怎么好，甲醇-水混合溶剂，还是不咋的——成了乳浊液了，跟牛奶似的，考虑到流动相里添加了酸，而该化合物又是碱，于是乎，滴加甲酸助溶，边滴加边振摇，样品终究给溶清了，0.45um滤过，备用，待分离。
先试试，小体积进样；观望ing，期待ing，留意系统反压，居然比平时类似色谱条件下，柱压高了1000多psi，眉头紧锁，有问题？！果然，出峰不正常，很快就出来了，居然没怎么保留！！！检查管路，流动相设置是否对应，没问题呀，难不成样品有问题？询问合成的同事，这个化合物是怎么做过来的。
不问不知道，一问吓一跳！！！样品含脂肪胺（二乙烯三胺），是反应起始原料之一，由于其沸点高（～200℃）旋干溶剂的时候根本没有除去。
赶紧测样品溶液的pH值，10左右，汗ing～～～，好在第一针是预试，进样体积小，不然制备柱就。
先前溶解样品时都用甲酸助溶了，没想到碱性居然还有这么强，没办法，只得中和了。
调整到偏酸性了，再次尝试。
这下倒是一切正常了，分离效果也不错！耶～∨，经这么折腾，梯度洗脱条件基本固定下来了，然后优化考察进样量，逐步增大上样量，正常，分离效果不错，再增加进样体积，还是分得不错！进一步增大，居然很快就洗下来了，明显地不正常！仔细一想，看来这个低分子有机胺对色谱分离是有影响的，只是在分析条件下、小体积进样一时没有表现出来而已。
既然是游离伯胺，能否用铜离子去络合呢？但是目标化合物也含有这个片段，也会同时被络合掉，没办法，看来只能小体积进样了，少量多次啦！就这样，一针、两针、三针。
边分离，边让同事回收已经收集好的组分。
一天过去了。
担心旋蒸去除溶剂的过程中样品变坏，取已经脱除溶剂的样品做个NMR H谱，结果大事不妙，噩耗啊，H谱上居然多出了个峰，仔细一看，甲酸意外地跟氨基干上了，旋蒸过程中游离伯胺被甲酰化了，苦笑不得呀。
冷静想想也正常，甲酸HCOOH，具有醛基，跟胺反应了。
幸好，幸好只溶解了少量的样品，大部分的膏状物还放在一边，还能经得起这次折腾。
（突然想起来老子的——“祸兮福之所倚，福兮祸之所伏”或者说“成也萧何，败也萧何”）看来，这种情况之下是不能用甲酸作为流动相添加剂了，改用TFA，况且TFA沸点比Formic Acid低，容易去除。
就这么改过来了，试试，效果还不错！但是有个潜在的问题没解决——体系里脂肪胺对色谱分离的影响！！这个比较麻烦，虽少量多次可以做，但太耗费时间和流动相了，还是得想办法增大进样量。
于是乎，斗胆，大体积进样一针，试试看？！结果正常，让人惊喜啊！再试试，看能否重复？结果令人失望！邪乎？再试，正常，再试，又不正常。
这么个周期下来很可能是上一针对下一针的色谱分离有影响。
但不敢肯定，于是乎，进个空白，再进样品，正常！！！如今，华山两条道——要么一针样品一针空白，要么想个法子把胺的影响消除掉。
一针样品一针空白，这么做太费时间了，也耗溶剂。
能否把胺给洗掉呢？仔细分析上面的图谱，发现上一针跟硅羟基作用的胺在下一针能部分洗下来的。
好，好，洗洗看！在洗脱梯度过后增加高比例水洗柱，再平衡柱子。
就这么尝试，管用！松了口气，就这么连续3天，分离出了足够量的样品。
哈哈，搞定！没想到，没想到的是，一波为平，一波又起！在去除溶剂回收目标化合物的过程中又出岔子了。
旋干溶剂后，样品成了三氟乙酸盐，加碱，调pH值，游离出来！打算这么干，将三氟乙酸除掉，可惜，三氟乙酸居然不能完全除去，做NMR19F谱，在化学位移-73左右能明显看到TFA的峰，可怜那位做合成的同事啊。
只能再来一次纯化了，过离子交换树脂，除去TFA。
这部分的工作是意料之外的。
幸好，幸好能搞掉，不然in vitro pharmacolog怎么办呀，TFA不把那些细胞毒死才怪！！！至此，事情有个令人满意的结局了，虽然中途破费周折。
痛定思痛，从这个case中，可以得出三点启发：1. Preparative HPLC分离纯化之前，必须对待分离化合物体系有充分的了解。
诸如目标化合物的溶解度——在流动相中的溶解度显得非常重要。
若溶解性差，易于柱头析出，小心添“堵”！另外，对于合成产物纯化而言，由于反应种类繁多、体系复杂，所用溶剂、酸碱催化剂均有可能对色谱分离产生影响（诸如合成反应过程中所用TFA、TEA、DEA、甲/乙基磺酸、三氟甲磺酸、吡啶、脂肪胺等）。
进样之前，是否需要预处理（比如调节样品溶液pH）2. Preparative HPLC分离纯化过程中，需实时密切关注系统压力，留意仪器设备工作状态。
若有反常现象则意味着某处有潜在的问题，考虑从样品溶液、流动相、仪器本身、色谱柱、检测器等各个方面排查。
3. Preparative HPLC分离纯化之后，在回收目标化合物时，需对其耐酸、碱性、热稳定性有所了解，谨防最后一步出乱子。
同时，结合具体情况，留心防范流动相添加剂的“副作用”。
“且做且学，且学且做，且做且行，且行且珍惜……”。