基因工程的操作步骤
基因工程操作步骤
基因工程操作步骤
基因工程是一种利用分子生物学技术对基因进行修改或操作的科学技术，包括四个主要步骤：DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定。
第一步：DNA提取
DNA提取是从细胞中分离出目标基因的第一步。
首先需要选择合适的来源，比如细菌、动物、植物等。
然后通过处理，如破碎、溶解等，使细胞内的DNA被释放出来，经过纯化和分离，得到纯净的DNA。
第二步：DNA插入
DNA插入是将目标基因插入到宿主细胞中的过程。
将目标基因与载体DNA连接，然后利用特定的酶（如限制酶）进行切割，使其与宿主细胞的某个位点相连。
将该DNA带入细胞内，使其成为宿主细胞的一部分。
第三步：细胞转化
细胞转化是将DNA插入到宿主细胞后，使宿主细胞接受和表达目标基因的过程。
目前流行的转化方法有三种：自然转化、化学转化和电转化。
其中，电转化是最常用的方法，它利用高压电脉冲对细胞进行短暂的电击，使其膜通透性增加，从
而使DNA进入细胞内。
第四步：筛选鉴定
筛选鉴定是用于鉴别宿主细胞是否成功接受和表达目标基因的过程。
利用限制酶切割、PCR扩增、Southern blotting等技术方法，可以检测宿主细胞是否带有目标基因；同时，也可以通过观察目标基因是否表达以及表达程度的多寡，来判断宿主细胞是否成功接受和表达目标基因。
总而言之，基因工程操作步骤需要经过DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定四个主要步骤，每一步都需要严格控制条件和操作，以保证结果的准确性和可靠性。
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程基本操作过程
基因工程基本操作过程基因工程基本操作过程基因工程（Gene Engineering）是指使用分子生物学技术来改造细胞的过程。
下面我们将介绍基因工程的基本操作过程：一、制备基因：1、搜集基因：首先根据要求选择合适的基因来构建一个基因组。
2、克隆基因：将选定的基因提取出来并复制多份，使得可以获得相当数量的基因，以便后续的基因工程。
3、比较基因：对不同基因的序列进行比较，以了解基因的相似性和差异性，这是判断基因是否有用的重要依据。
4、无编码的RNA转录：将DNA 序列转录成RNA 序列，以及无编码RNA（rRNA）的转录，其中，rRNA 是控制基因表达水平的重要因素之一。
二、构建基因组：1、生成基因组：将制备的基因进行拼接成合适的串联，形成某一特定的基因组。
2、调节基因表达：通过调节基因组中基因的表达水平，使其达到适当的状态，以获得最大的效果，可以采用基因转录调节、基因表达调节等技术。
3、重组基因：改变基因组中基因的构型或序列，从而得到新的可用基因，可以采用重组质粒、 PCR（聚合酶链反应）技术等。
三、进行工程化：1、在细胞中引入外源基因：将制备的基因组注入细胞中，使其形成线粒体遗传系统，从而改变细胞的特性。
2、提取细胞中的基因：从细胞中提取所需要的基因，以便进行分析和研究。
3、可视化基因分析：对细胞中的基因进行可视化分析，以了解基因的结构及作用，可以采用流式细胞术、免疫组化等技术。
四、应用基因工程技术：1、制作新的药物：利用基因工程技术可以设计新的药物，以治疗疾病2、生产更优质的农作物：通过改造作物自身的基因，可以获得更高品质的农作物，提高农业的生产效率。
3、开发先进的器械设备：基因工程技术可以应用于开发先进的机械设备，以提高工程制造的效率和质量。
以上就是基因工程的基本操作过程，在实际应用中，可以结合不同的技术，创新性的进行工程化以实现一定的目的。
基因工程的操作程序
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
将目的基因导入 微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程（1）.基因（2）.基因的构建方法
通过对受体菌的培养而储存基因 基因组的构建cDNA的构建-----反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
目的基因的mRNA
单链DNA
1
2
3
6
5
4
双链DNA (目的基因)
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件：
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程一、概述基因工程是利用分子生物学、细胞生物学等技术对基因进行改造、合成和修饰的过程。
通过基因工程，可以实现对生物体的遗传信息进行精准地操作和改变，从而创造出具有特定功能或性状的新型生物体。
二、DNA提取在进行基因工程之前，需要先从目标生物体中提取出其DNA。
DNA提取是一个关键步骤，它决定了后续操作的成功率和效果。
1. 样品采集首先需要从目标生物体中采集样品。
样品可以是血液、组织、细胞等。
2. 细胞破碎将采集到的样品放入离心管中，加入裂解缓冲液并振荡破碎细胞壁使DNA释放出来。
3. DNA纯化通过离心等方法将杂质去除，使得纯化后的DNA可用于后续操作。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种利用酶的作用扩增目标DNA序列的技术。
PCR扩增可以将目标DNA序列扩增到足够多的数量，便于后续操作。
1. 反应体系准备将PCR反应体系中所需的酶、缓冲液、引物和模板DNA等混合均匀。
2. 反应条件设置根据所需扩增的DNA序列长度、GC含量等因素，设置PCR反应的温度、时间和循环次数等参数。
3. PCR扩增将反应体系放入PCR仪中进行扩增，经过若干轮循环后，可得到大量目标DNA序列。
四、限制性内切酶切割限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
通过使用不同的限制性内切酶，可以实现对目标DNA序列的精准切割和拼接。
1. 酶切体系准备将限制性内切酶加入到目标DNA溶液中，并加入适量的缓冲液和辅助物质。
2. 酶切条件设置根据所需的酶切位点和目标DNA序列特点，设置相应的温度、时间等条件。
3. 酶切反应进行将反应体系放入恒温水浴中进行反应，待反应结束后可得到经过精确切割后的DNA片段。
五、质粒载体构建质粒载体是一种能够在细胞内进行复制和表达的DNA分子。
通过将目标DNA序列与质粒载体进行连接，可以实现对目标基因的表达和功能调控。
1. 质粒载体准备选择适合的质粒载体，并进行线性化处理。
简述基因工程的含义和基本操作步骤
简述基因工程的含义和基本操作步骤基因工程是通过对生物体的遗传物质进行人为改变和调控，以获得新的性状或功能的一种技术。
基因工程是现代生物技术的重要组成部分，利用DNA重组技术和基因编辑技术，可以在基因水平上改变生物体的遗传性状，进而实现种种应用。
基因工程的基本操作步骤如下：1.目标基因的克隆:首先，需要确定需要改变的目标基因，并将其从原有的生物体中克隆出来。
常用的克隆方法包括PCR技术、限制酶切和连接、质粒克隆等。
2.重组质粒构建:将目标基因插入载体中，形成重组质粒。
常用的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
3.质粒转化:将重组质粒导入宿主细胞中，使宿主细胞获得目标基因。
常用的转化方法包括化学转化、电穿孔和嗜热菌转化等。
4.选择与筛选:利用特定标记或抗性基因，对转化细胞进行筛选，筛选出带有目标基因的细胞进行进一步培养和研究。
5.培养与表达:对获得目标基因的细胞进行培养，利用适当的诱导条件（如添加特定诱导剂、调节培养温度等），使目标基因在细胞中表达出来。
6.分离与纯化:通过适当的分离和纯化技术，将目标基因表达产物纯化出来。
常用的方法包括离心、凝胶过滤、层析等。
7.特性鉴定与功能分析:对目标基因表达产物进行特性鉴定和功能分析，确认其结构和功能。
常用的方法包括Western blot、PCR、酶活性测定、功能性实验等。
8.应用与开发:在确认目标基因的结构和功能后，可以根据需要进行应用和开发。
基因工程的应用领域非常广泛，包括生物农业、医药、环境保护等。
基因工程的应用非常广泛，以下列举几个常见的应用领域：1.农业领域:利用基因工程技术改良作物，使其具有抗病虫害、耐逆境和提高产量等优点。
常见的基因工程作物包括转基因水稻、玉米和大豆等。
2.医学领域:基因工程技术可以用于生产重组蛋白药物、疫苗和基因治疗等。
同时，也有助于研究和发现与疾病相关的基因。
3.环境保护:基因工程技术可以用于修复污染物、处理有害废物，提高生物降解能力等。
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作包括以下几个步骤：
1. 取得目标基因：首先需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法实现，如克隆、PCR扩增、合成等。
2. DNA切割：将目标基因从DNA样本中分离出来，通常需要用到一种特殊的酶——限制性内切酶。
这些酶可以在DNA的特定序列处切割，从而得到目标基因的DNA片段。
3. DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接在一起。
载体DNA是一种能够自复制的DNA分子，可以在细胞中稳定存在。
连接的过程通常需要使用DNA连接酶。
4. 转化：将连接好的DNA载体导入宿主细胞中。
这可以通过多种方法实现，如电穿孔、热激击等。
5. 克隆和筛选：选择合适的宿主细胞，并用培养基培养细胞，使其增殖。
通过筛选方法，如抗生素筛选、荧光检测等，筛选出带有目标基因的克隆。
6. 验证：对获得的克隆进行验证，确认目标基因已经成功导入宿主细胞，并且在细胞中表达。
7. 基因表达和应用：利用已经导入细胞中的目标基因进行进一步的研究。
可以通过控制基因的表达水平，探究基因的功能和
调控机制。
同时，还可以利用基因工程技术将目标基因导入其他生物体，实现特定性状的改良和应用。
基因工程的基本操作步骤
基因工程的基本操作步骤1.获得目标基因：确定所需的目标基因，可以通过从已知基因库中克隆目标基因，或者通过后续的基因特异性扩增来获得目标基因片段。
2.克隆和扩增目标基因：将获得的目标基因片段插入到载体（如质粒、病毒等）中，通过体外扩增技术（如聚合酶链式反应，PCR）增加目标基因的拷贝数目。
3.DNA测序：对扩增的目标基因进行测序，以确认其序列是否和期望的一致。
这对于进一步的克隆和分析十分重要。
4.选择适当的宿主：根据目标基因的特性，选择合适的宿主生物。
可以选择细菌、植物、动物细胞等不同的宿主。
5.转化宿主：将目标基因插入宿主细胞中，使其能够被细胞内的基因表达系统所识别和表达。
6.筛选和鉴定：对转化过的宿主进行筛选，以确定是否成功地将目标基因表达在宿主中。
这可以通过各种技术，如荧光标记、抗性筛选等进行鉴定。
7.基因表达和改造：在宿主中实现目标基因的表达，并进行必要的改造。
这包括调控基因表达水平、改变基因产物的结构和功能等操作。
8.分析和验证：对基因表达和改造的结果进行分析和验证。
这可以通过分子生物学技术、生物化学方法、功能性实验等手段来实现。
9.后续应用：根据实验目的和应用需求，对基因工程产物进行进一步的应用和开发。
这可以涉及到基因工程产品的应用领域，如医药、农业、工业等。
除了上述的基本操作步骤，基因工程还需要进行严格的实验设计、对操作过程进行质量控制和数据分析。
此外，基因工程的操作过程还需要遵守相关的伦理原则和法律法规，确保实验的安全性和合规性。
需要注意的是，基因工程是一个复杂的过程，具体的操作步骤可能因不同的实验目的、技术手段和宿主生物的选择而有所差异。
因此，在实际操作中，可能需要根据具体情况进行调整和优化。
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第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA 链降解，使之变成单链的DNA。
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。基因组和部分基因组(cDNA)比较
与模板互补的DNA双链） 重复循环
2、具体过程
PCR(多聚酶链式反应)
3、人工合成的目的基因
1）反转录法：
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录成互 补的单链DNA，然后在酶的 作用下合成双链DNA，从而 获得所需的基因。
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA (cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
2、利用PCR技术扩增目的基因
概念：PCR全称为__聚__合__酶__链__式__反_应__，是一项在生物体__外__复制 特__定_D_N_A_片__段__的核酸合成技术
原理： DNA复制
条件： 模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） Mg2+(激活剂) 缓冲溶液 一对引物：一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移 动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录 然后脱落)
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信化学方法人工合成
一、目的基因的获取（一）从基因中直接获取 1.基因：概念见P9
2.基因的分类:按外源DNA片段的来源分类
种 基因组DNA：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了目的基因导入受体细胞---植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
易感染双子叶植物和裸子植物，对 大多数单子叶植物没有感染能力
将目的基因导入受体细胞---动物细胞 显微注射法
将目的基因导入受体细胞---微生物细胞 Ca2+处理
使细胞处于一种能吸收周围环境中的 DNA---感受态细胞
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
• 1.目的基因的获取 • 2.基因表达载体的构建 • 3.将目的基因导入受体细胞 • 4.目的基因的检测与鉴定
知识点一：1.原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 没有启动子，基因就不能转录。
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质
mRNA
的氨基 推测的核苷
酸序列 酸序列
结构基因 推测 的核苷酸
序列
化学 合成
目的 基因
二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 表达和发挥作用。
所需物质：
2、基因表达载体的组成：
非编码区
①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白 质。
②有调控遗传信息表达的核苷酸序列， 在该序列中，最重要的是位于编码区 上游的RNA聚合酶结合位点。
知识点一：2.真核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
编码区
非编码区 编码区下游
启动子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
终止子
外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因（DNA分子杂交技术） 是否转录（mRNA分子杂交技术） 是否翻译（抗原—抗体杂交技术）
鉴定:
功能活性鉴定 抗性鉴定
分别提取什么进行检测
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
ห้องสมุดไป่ตู้
真核细胞
编码区是 _连_续___的
编码区是间隔的、 _不_连__续_的
都由能够编码蛋白质的_编__码_区__和具 有调控作用的__非_编__码_区组成的
思考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的 目的基因。
4.获取目的)
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连cDNA合成过程
内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内 含子
非编码区 编码区上游
启动子 与RNA聚合酶 结合位点
编码区
外显子
内含子
非编码区 编码区下游
终止子
真
核
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
细
内含子：不能编码蛋白质的序列
胞
的
基
非编码区 有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的
因
RNA聚合酶结合位点等。
结
构
注意
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加 了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的 化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合 成引物
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列， 以便合成引物。
过程
预变性（增加DNA变性的概率）
高温变性（解旋为单链）
低温退火（引物与单链互补结合） 适温延伸（在Taq酶的作用下合成
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
启动子：位于基因的首端的一段特殊 的DNA片断，它是RNA聚合酶识别 和结合的部位，有了它才能驱动基因 转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的 基因的细胞筛选出来