酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
C6
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+ 短杆状、无芽孢 短杆状、无芽孢
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C7
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+ 短杆状、无芽孢 杆状、无芽孢
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C8
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+ 杆状、无芽孢
杆状、无芽孢
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注: + 实验结果阳性, - 实验结果阴性, * 实 验结果与要求 相符, 进 行后续实验。
2 1 3 分离菌株 16S rDNA 序列分析鉴定: 将得到 的 4 组序列在 NCBI 数据库中进行 16S rDNA 序列同 源性分析, 菌株 B1、B3 与 C. butyricum 的同源 性分 别达 100% 、99% , 均属于梭菌属群 丁酸梭菌种。 2 2 丁酸梭菌的生长特性
丁酸梭菌和致病菌混合培养: 活化好的丁酸梭 菌和致病菌菌液均稀释到 104cfu mL~ 105 cfu mL, 各 取 0 1 mL 接种 到 9 8 mL RCM 液体 培养 基中, 置 37 静 止培 养。 分别 在 0h、4h、8h、12h、16h、20h、 24h、36h、48h 取样测活菌数和 pH 值, 并与单独培养 相比较[ 9~ 10] 。
浓香型白酒窖泥梭菌的分离及其挥发性代谢产物分析
浓香型白酒窖泥梭菌的分离及其挥发性代谢产物分析何培新;李芳莉;郑燕;张勇;胡晓龙;孙西玉;郭福利【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)004【摘要】从河南张弓老酒酒业的窖泥中分离厌氧梭菌属细菌,基于微生物16S rRNA基因序列分析对分离到的细菌进行鉴定;采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术萃取和检测了分离菌株发酵液中的挥发性代谢产物.结果表明,分离到的88株细菌与基因库中8种芽孢梭菌(Clostndium celerecrescens、C.cochlearium、C carboxidivorans、C.sporogenes、C.sartagoforme、C.thernopalmarium、C.aurantibutyric啪和C.butyricum)具有较高的序列同源性.从分离菌株的发酵液中共检测到20种酯类、12种酸类、11种醇类和4种醛类物质,还有一部分酮类和醚类物质;其中主要的酯类物质有丁酸乙酯、丁酸丁酯、3-苯丙酸乙酯等,酸类物质主要为丁酸和己酸,醇类物质主要为丁醇、己醇和3-苯丙醇.本研究有助于进一步揭示窖泥中可培养梭菌菌群对浓香型白酒风味的贡献.%Anaerobic Clostridium spp.were isolated from pit muds at Henan Zhanggong Laojiu,and identified based on 16S rRNA gene sequence analysis.The volatile metabolites of these isolates were extracted by H S-SPME and determined by GC-MS.The results suggested that the 88 bacterial strains showed high sequence similarities with 8 Clostridium spp.in GenBank,including Clostridiumcelerecrescens,C.cochlearium,C.carboxidivorans,C.sporogenes,C.sartagofor me,C.thermopalmarium,C.aurantibutyricum,and C.butyricum.A total of 20esters,12 acids,11 alcohols and 4 aldehydes,and some ketones and ethers were detected from the metabolites of Clostridium spp.fermentation broth.Among them,ethyl butyrate,butyl butyrate and 3-benzene ethyl propionate were dominant esters;butyric acid and caproic acid were dominant acids;butanol,hexanol and 3-phenylpropanol were main alcohols.The study was helpful to reveal the contribution of the cultivable Clostridium spp.from pit mud to the flavor constitution of strong-flavor Baijiu (Chinese liquor).【总页数】5页(P45-49)【作者】何培新;李芳莉;郑燕;张勇;胡晓龙;孙西玉;郭福利【作者单位】郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450001;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450001;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450001;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450001;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州450001;河南牧业经济学院生物工程学院,河南郑州450001;河南张弓老酒酒业有限公司,河南宁陵476733;河南张弓老酒酒业有限公司,河南宁陵476733【正文语种】中文【中图分类】TS261.1【相关文献】1.浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析2.基于HS-SPME-GC-MS的浓香型白酒窖泥中可培养Clostridium spp.挥发性代谢物成分分析3.基于HS-SPME-GC-MS的浓香型白酒窖泥中可培养Clostridium spp.挥发性代谢物成分分析4.浓香型白酒窖泥中梭菌的分离、鉴定及产丁酸性能的比较研究5.浓香型白酒窖泥放线菌的原位分离及代谢特性研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
丁酸梭菌
小鼠肠道内丁酸梭菌的分离及鉴定小结：两种不同培养基分离丁酸梭菌的比较1.实验材料1.1样品来源：小鼠盲肠内容物1.2 培养基：梭菌增殖培养基(RCM 培养基) :酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、0.5 %美蓝0.2 mL 、琼脂15g(固体培养基时用) 、蒸馏水1000 mL ；调节pH 7.1±0.1，1×105Pa，灭菌20min备用。
强化梭菌培养基：蛋白质10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.1±0.1，1×105Pa，灭菌20min。
硫乙醇酸盐流体培养基：胰蛋白胨，酵母浸出粉，葡萄糖，L-半胱氨酸，氯化钠，硫乙醇酸钠，刃天青，琼脂，蒸馏水1000mL，115℃，30min灭菌后备用。
产酸指示培养基：在强化梭菌培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中加入3mL质量浓度为0.4g/dL的溴甲酚紫。
明胶液化培养基：在强化梭菌培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中加入12g/dL的明胶即可。
醋酸铅琼脂培养基：强化梭菌培养基或硫乙醇酸盐流体培养基100mL，10%硫代硫酸钠溶液2.5mL，10%醋酸铅溶液3mL。
石蕊牛乳试验培养基：将脱脂牛奶的pH调至中性，用石蕊将牛奶调至淡紫色偏蓝为止。
2.实验方法2.1分离培养方法本实验中，运用厌氧菌培养罐(沈阳市第五人民医院生产) 来进行厌氧菌液体培养、分离和稀释平板计数。
丁酸梭菌的分离：1) 取小鼠盲肠内容物，以1：3加入无菌水中，置80 ℃水浴10 min ，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，37 ℃厌氧培养48h。
2) 将上述培养液转入强化梭菌液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中，37 ℃厌氧选择性富集培养48h。
3) 梯度稀释培养液，分别涂布于相应的强化梭菌液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基平板，置入厌氧培养罐，37 ℃培养48h。
浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析
浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析窖泥质量对浓香型白酒品质具有重要影响,窖泥中的产酸功能菌群对窖泥功能及浓香型白酒品质具有十分重要的作用。
目前对浓香型白酒窖泥的研究主要集中于解析窖泥中微生物群落结构,对窖泥中碳物质循环与微生物群落动态变化规律及与窖泥质量关系的研究相对较少。
窖泥微生物属于厌氧发酵体系,其研究的难点在于大量具有重要代谢功能的微生物在实验室条件下难以培养。
建立合适的可培养技术,并此基础上研究窖泥微生物的代谢功能显得尤为重要。
窖泥微生物的功能需要通过其代谢特征来反映。
本研究通过构建窖泥产酸菌群发酵模拟体系,建立了难培养产己酸菌群快速富集方法,并通过发酵模拟体系研究窖泥产酸菌群的代谢特征。
同时,采用16S rRNA扩增子测序技术研究富集混菌的群落组成情况。
通过厌氧难培养微生物的可培养技术,筛选分离新型葡萄糖营养型产己酸单菌,通过发酵研究其代谢功能,为窖泥中厌氧产己酸功能微生物的研究提供理论参考。
本论文主要研究结果如下:（1）通过窖泥产酸菌群发酵,对窖泥混菌发酵模拟体系的碳源选择、处理方式进行了探索和研究。
研究发现窖泥混菌可以直接利用葡萄糖产生含量可观的己酸,且该现象在不同产地浓香型酒厂窖泥中普遍存在,窖泥可培养己酸产量最高可达6.68 g?L<sup>-1</sup>。
以葡萄糖为碳源的产酸菌群底物利用效率、菌体生长速率、己酸产量要明显优于乙醇碳源。
发酵后期窖泥产孢混菌相比发酵前期的营养菌体,具有更加稳定的产己酸能力。
窖泥热激混菌特定种属PCR验证中,未发现克氏梭菌基因组,在实际的浓香型白酒酿造体系中,存在除克氏梭菌外的其他己酸合成梭菌。
（2）窖泥产酸菌群在发酵时间进程中,代谢产物丁酸、己酸的变化具有明显的规律性。
窖泥可培养发酵初期3 d,丁酸的含量普遍较高;发酵至7 d及以后,各样品己酸产量相较3 d均有明显增加,而丁酸的含量则降低。
这表明,葡萄糖营养型产己酸菌群可利用丁酸作为其合成己酸的前体物质。
窖泥中高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及其生长耐受性研究
2021 Vol.40 No.3•134・ Serial No.349China BrewingResearch Report窖泥中高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及其生长耐受性研究衡文,，李韬I ,叶光斌I ,邹伟8**收稿日期*2020-11-30修回日期*2020-01-27基金项目：五粮液集团-四川轻化工大学产学研合作项目(CXY2019ZR011)；四川轻化工大学人才引进项目(2018RCL27, 2020RC36)固态酿造四川省院士 (专家)工作站项目(2017YSGZZ03)作者简介:衡文(1996-),女，硕士研究生，研究方向食品微生物。
*通讯作者:邹 伟(1985-)，男,副教授，博士，研究方向为酿酒微生物。
(1.四川轻化工大学生物工程学院/四川宜宾644005;2.五粮液集团有限公司/四川宜宾644000)摘 要:从浓香型白酒窖泥中通过传统微生物分离手段筛选高产丁酸的梭菌，并对分离菌株进行形态学观察、分子生物学鉴定及生 长耐受性分析研究。
结果表，通过 产物检测获得两株高产丁酸菌，编号为AB2RH027和AB2RH033,经过菌落、革兰氏染色及分子生物学鉴定两株菌均为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
通过耐受性实验，确定菌株AB2RH027最适生长pH 值为8,最适生长温度为40 酒精耐受性为15%vo 1,发酵24 h 丁酸产量为5.29 g/L ；菌株AB2RH 033最适生长pH 值为8,最适生长温 为35 酒精耐受性为18%vol , 24 h 丁酸产量为5.23 g/L 。
该研究筛选得到的两高产丁酸的菌株在白酒 提升方面 定应用价值。
关键词:浓香型白酒;窖泥;高产丁酸;菌 筛选;耐受性中图分类号:TS261.1 文章编号 *0254-5071 (2021)03-0134-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.03.025引文格式:衡文，李韬，叶光斌，等•窖泥中高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及其生长耐受性研究!J ].中国酿造,2021,40(3):134-13 &Screening and identification of high-yield butyric acid Clostridium sp. strain and its growth toleranceHENG Wen 1, LI Tao 1, YE Guangbin 1, ZOU Wei 2*(l.College of B ioengineering, Sichuan University of S cience and Engineering, Yibin 644005, China;2. Wuliangye Group Co., Ltd., Yibin 644000, China)Abstract ： High-yield butyric acid Clostridium sp. strains were screened from the pit mud of strong-flavor Baijiu (Chinese liquor) through traditional microbial isolation method. The screened strains were studied by morphologic observation, molecular biological identification and growth tolerance analysis. The re sults showed that two strains AB2RH027 and AB2RH033 with high yield of butyric acid were obtained by fermentation product detection, and were identi fied as Clostridium butyricum by colony observation, gram stain and molecular biotechnology. Based on the tolerance experiments, the results showed thatthe optimal growth pH and temperature of strain AB2RH027 was 8 and 40 !, the alcohol resistance was 15%vol, and the butyric acid yield was 5.29 g/L for fermentation 24 h. The optimal growth pH and temperature of strain AB2RH033 was 8 and 35 !, and alcohol resistance was 18%vol. The yield ofbutyric acid was 5.23 g/L for fermentation 24 h. The two strains with high yield of butyric acid had certain application value in improving Baijiu quality.Key words ： strong-flavor Baijiu ; pit mud; high yield of butyric acid; strain screening; tolerance浓香型白酒窖泥孕育了种类丰富、数量繁多、功能各 异的微生物，为产酸呈味、产酯生香提供了良好的生存环境,被称作“微生物黄金咽。
丁酸梭菌的固态培养及益生效果研究的开题报告
丁酸梭菌的固态培养及益生效果研究的开题报告一、研究背景和意义：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一种常见的厌氧菌，主要分布在土壤、动物肠道及水体中。
作为一种益生菌，丁酸梭菌在人类消化道中具有多种生理功能，如促进食物消化、维持肠道内稳定微生态环境、增强免疫力等。
此外，丁酸梭菌还可应用于食品工业、农业、生物制药等领域，具有广阔的应用前景。
因此，对丁酸梭菌的深入研究具有重要的科学意义和实用价值。
目前，对于丁酸梭菌的研究主要集中在液态培养方面，固态培养及其对宿主的益生效果的研究较为缺乏，因此有必要开展本研究，以期深入了解丁酸梭菌在固态培养情况下的生长特性和对宿主的益生效果，为进一步应用丁酸梭菌提供理论和实践基础。
二、研究内容和方法：本研究将重点研究丁酸梭菌在固态培养情况下的生长特性和对宿主的益生效果。
具体研究内容如下：（1）建立适宜的丁酸梭菌固态培养方法。
通过改变不同的培养基成分、添加不同的生长因子和调节不同的环境因素等方式，优化固态培养条件，建立适宜的丁酸梭菌固态培养方法。
（2）考察固态培养对丁酸梭菌生长特性的影响。
通过比较液态培养和固态培养下丁酸梭菌的菌落数、生长态势及代谢产物的变化等，探究固态培养对丁酸梭菌生长特性的影响。
（3）评估丁酸梭菌固态培养对小鼠益生效果的影响。
将丁酸梭菌固态培养物与普通饲料进行混合，让小鼠饮食，并考察其对小鼠的益生效果，如改善肠道微生态、增强免疫力等。
本研究采用的主要方法包括固态培养技术、微生物计数法、代谢产物分析方法、小鼠模型等实验方法。
三、研究预期结果：本研究的预期结果包括以下几个方面：（1）建立适宜的丁酸梭菌固态培养方法，为该菌的应用提供技术支持。
（2）揭示固态培养对丁酸梭菌生长特性的影响规律，为该菌在固态环境下的应用提供理论依据。
（3）评估丁酸梭菌固态培养对小鼠益生效果的影响，为物种的宏观应用提供科学支持。
四、研究价值：本研究的主要价值包括：（1）深入了解丁酸梭菌在固态培养情况下的生长特性，为该菌的应用提供理论基础和实践指导。
丁酸梭菌的分离、鉴定与基本特性研究
丁酸梭菌的分离、鉴定与基本特性研究樊晓璐;张苇莉;吴幼茹;邹毅;李楠【摘要】9 pure strains were isolated from dunder liquid (added during rum fermentation process) through anaerobic incubation. One of the strains was named Y-1 and it was identified as Clostridium butyricum after physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. The basic growth characteristics of Y-1 as well as its security were studied. The results demonstrated its strong tolerance to acid and alcohol, and its great capacity of producing acids. The optimum temperature for its growth was 37℃, the best growth pH was 7.0, and its fullest tolerance to alcohol was 9%vol and to acid was pH 4.0. Besides, it played an important role in the process of rum fermentation as the functional microorganism for the formation of fragrance and taste.%通过厌氧培养法从朗姆酒发酵过程添加的丹多液中分离得到9株纯菌株,经过生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定出1株丁酸梭菌Y-1.研究了Y-1的基本生长特性和安全性,结果表明,其具有较强的耐酸和耐酒精以及产酸能力,发现菌株在梭菌增殖培养液中最适生长温度为37℃,最适生长pH值为7.0,菌株对于酒精的最高耐受能力为9%vol,耐酸能力最低pH 值为4.0.丁酸梭菌作为功能微生物在朗姆酒发酵过程中对香气及风味物质的形成具有重要作用.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2017(000)011【总页数】7页(P31-37)【关键词】朗姆酒;丹多液;丁酸梭菌;分离;鉴定【作者】樊晓璐;张苇莉;吴幼茹;邹毅;李楠【作者单位】广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004;广西大学糖业工程研究中心,广西南宁530004;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004【正文语种】中文【中图分类】TS262.28;TS261.4;TS261.1丁酸梭菌(Clostridium butyricum),属于芽孢杆菌科（Bacillaceae），梭菌属（Clostridium）[1]，有芽孢，革兰氏阳性菌，在老培养物中或可变为革兰氏阴性菌，是一种严格厌氧菌[2-3]。
一株丁酸梭菌的分离鉴定及生物学特性研究
一株丁酸梭菌的分离鉴定及生物学特性研究作者：翟凯旋李金香冷敦鹏臧学运于蓬勃苗越齐慧东来源：《家禽科学》2024年第07期摘要：本試验通过厌氧培养法从健康鸡的新鲜粪便中分离筛选得到1株菌株，从形态学观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析等方面对菌株进行鉴定，确定该菌株为丁酸梭菌。
对其生物学特性进一步研究，发现该菌株能够产生乙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等多种肠道致病菌均有一定的抑菌能力。
综上所述，该菌株在生长、抗逆、产酸、抑菌方面表现较好，具有很好的应用价值。
关键词：丁酸梭菌；分离鉴定；生物学特性中图分类号：S816.7 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）07-0009-09丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又被称为丁酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌，是一种菌体呈杆状或弯曲状、周身被鞭毛包围的专性厌氧的革兰氏阳性菌，隶属芽孢杆菌科（Bacillaceae）、梭菌属（Clostridium）[1]，广泛存在于动物消化道、粪便、土壤和各种发酵产物中[2-3]。
作为革兰氏阳性菌里特有的肠道益生菌，丁酸梭菌能够在动物消化道中分泌多种代谢产物，其中最主要的代谢产物丁酸，有助于维持动物肠道上皮细胞的完整性，促进肠上皮组织的发育[4–6]。
此外，丁酸梭菌能够产生淀粉酶、蛋白酶等多种胞外酶以及核黄素、维生素K、B 族维生素等，可有效增强肠道上皮细胞的功能，改善营养物质利用率，提高有益菌丰度，竞争性抑制有害菌的生长，维持肠道健康[7-8]。
丁酸梭菌可形成具有极强耐受性的芽孢，因此对各种环境的适应能力较强[9-10]。
近年来，丁酸梭菌作为饲料添加剂在增强动物免疫功能、促进肠道健康、防治细菌性疾病等方面表现出积极作用，具有广阔的应用前景及开发潜力[11]。
因此，为了进一步筛选优良的丁酸梭菌，本研究从健康鸡的新鲜粪便中分离出1株丁酸梭菌，通过形态学比较、生理生化试验、系统进化关系分析确定其物种和亲缘关系，并对菌株的生长、产酸及抑菌能力进行初步分析，为开发畜禽可用的优良丁酸梭菌饲料添加剂奠定基础。
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耐胆汁实验： 取０ １ ２ ８ ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接种 于含 ０ １ ％、 ０ ３ ％、 ０ ５ ％猪胆盐的 ２ ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培 养基中。置 ３ 分别于 ０ 、 、 、 进 ７℃培养箱中， ｈ １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
］ ７ ～ ９ 行活菌计数， 计算存活率［ 。
致病菌的单独培 １ ２ ９ 肠道致病菌体外拮抗实验： 养： 将０ 活化好的致病菌菌悬液转接入 ９ １ｍ Ｌ ９ｍ Ｌ 置３ 分别在 ０ 、 、 Ｒ Ｃ Ｍ液体培养基， ７℃静止培养， ｈ ４ ｈ 、 、 、 、 、 、 ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ取 菌 液 测 活 菌 数 和 ｐ Ｈ值。 丁酸梭菌和致病菌混合培养： 活化好的丁酸梭
取０ 接种到 ９ 置３ １ｍ Ｌ ８ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培养基中， ７ 、 、 、 、 、 、 、 ｈ ４ ｈ ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ℃静止培养。分别在 ０ 、 取样测活菌数和 ｐ 并与单独培养相比 ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ Ｈ值，
］ １ ０ ～ １ １ 较［ 。
年３ （ ） ２ ０ ０ ７ ４ ６
微生物学通报
·１ · ９
酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
谢树贵 戴 青 赵述淼 梁运祥
（ 农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院 武汉 ） ４ ３ ０ ０ ７ ０
摘要： 通过厌氧培养法从酒窖底泥中分离得到 １ 个菌株， 生理生化实验和 １ 株丁酸梭 ４ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定出 ２ 菌。选取丁酸梭菌菌株 Ｂ 研究了其生长特性和安全性， 体外研究表明其具有较强的耐酸、 耐胆汁和耐抗生素能 １ 力， 并能显著抑制常见肠道致病菌的生长， 具有作为饲用微生态制剂应用的潜力。 关键词： 丁酸梭菌， 分离， 鉴定， 益生菌 中图分类号： Ｑ ９ ３ ９ １ 文献标识码： Ａ 文章编号： （ ） ０ ２ ５ ３ ２ ６ ５ ４ ２ ０ ０ ７ ０ ６ ０ ０ ０
［ ］ ３ 杰细菌鉴定手册》 和《 常见细菌系统鉴定手册》 配 ］ ４ 制［ 。 ５
性试验， 参照 Ｇ Ｂ１ ５ １ ９ ３ ３ ２ ０ ０ ３最 大 耐 受 剂 量 法 进 行。取体重在 １ 的小鼠雌雄各 １ 只， 观察 ８ｇ ～ ２ ２ｇ ５ 后， 一日内分 ３次经口给予 ０ ３ ｄ ２ ５ｇ ? ｍ Ｌ菌液 ０ ４ （ 相当于 １ 体重） ， 连续 １ 观察小鼠是 ｍ Ｌ ５ ０ ０ ０ｍ ｇ ? ｋ ｇ ４ ｄ 否有中毒和死亡现象。 接种 １ １ ２ ６ 耐药性实验： ％菌液于常用浓度抗生 置３ ， 观察生长 素Ｒ Ｃ Ｍ培养基中， ７℃厌氧培养 ２ ４ ｈ 情况。 取０ １ ２ ７ 耐酸性实验： ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接 种于含有 ２ｍ 、 、 Ｌ无菌磷酸缓冲液的 ｐ Ｈ１ ０ ｐ Ｈ２ ０ 厌氧试管中， 置３ 分别于 ０ 、 ｐ Ｈ３ ０ ７℃培养箱中， ｈ
４ ５ 菌和致病菌菌液均稀释到 １ ， 各 ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ ～ １ ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ
明胶液化试 １ ２ ２ 分离菌株生理生化实验鉴定： 验、 密二糖、 松三糖、 淀粉水解试验和石蕊牛乳试验
［ ］ ３ 参照《 伯杰细菌鉴定手册》 和《 常见细菌系统鉴定 ［ ］ ４ 进行。 手册》
浙江省重大科技攻关项目（ 计划编号： ） ２ ０ ０ ４ Ｃ １ ２ ６ １ ０ 通讯作者
： ， ： Ｔ ｅ ｌ ０ ２ ７ ８ ７ ２ ８ １ ０ ４ ０ Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｆ ａ ｌ ｙ ｘ ＠１ ６ ３ ｃ ｏ ｍ 收稿日期： ， 修回日期： ２ ０ ０ ７ ０ ２ １ ２ ２ ０ ０ ７ ０ ４ ２ ８
［ ］ １ ～ ２
分离得到性状优良的丁酸梭菌， 并在体外研究了其 耐酸、 耐胆盐、 耐抗生素和拮抗致病菌特性， 为丁酸 梭菌的分离应用提供了一定依据。
１ 材料与方法
１ １ 实验材料 湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八 １ １ １ 样品采集： 镇基酒基地酒窖底泥 猪大肠杆菌（ ） 和肠 １ １ ２ 菌种： Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｔ ｉ ｃ ｈ ｉ ａｃ ｏ ｌ ｉ Ｋ ８ ８ 炎沙门氏菌（ ） 由华中农业 Ｓ ａ ｌ ｍ ｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａＥ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｄ ｉ ｓ Ｏ ４ Ｈ ｉ 大学农业微生物国家重点实验室提供。 梭菌增殖培养基（ ： 酵 １ １ ３ 培养基： Ｒ Ｃ Ｍ 培养基） 母浸膏 ３ｇ 、 牛肉浸膏 １ 、 胰蛋白胨 １ 、 葡萄糖 ５ ０ｇ ０ｇ 、 可溶性淀粉 １ｇ 、 氯化钠 ５ｇ 、 三水合乙酸钠 ３ｇ 、 半 ｇ 胱氨酸盐酸盐 ０ 、 、 琼脂 １ ５ｇ ０ ５ ％美蓝 ０ ２ｍ Ｌ ５ｇ （ 固体培养基时用） 、 蒸馏水 １ ； 调节 ｐ ０ ０ ０ｍ Ｌ Ｈ７ １ ± ， 灭菌备用。 ０ １ １ １ ５℃， ２ ０ｍ ｉ ｎ
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丁酸梭菌， 即酪酸梭菌， 是１ ９ ３ ３年由日本千叶 医科大学宫入近治博士首先发现并报告的， 因此又 名宫入菌。日本最初将其用作整肠剂， 广泛用于肠 道菌群失调， 急慢性腹泻， 肠易激综合症， 抗生素相 关性肠炎等疾病的治疗； 现也将其用于畜禽饲料添 加剂替代抗生素， 发挥防病促长的作用。丁酸梭菌 形成内生芽孢， 具有耐高温、 耐酸、 耐胆盐、 耐部分抗 生素等特性，作为饲料添加剂和兽药， 与非芽孢类 活菌制剂相比， 具有更为广阔的应用前景
提取纯 １ ２ ３ 分离菌株 １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定： ， 设计 Ｐ ： 化细 菌 总 Ｄ Ｎ Ａ Ｃ Ｒ 引 物 分 别 为： Ｐ ０ ５ ′ ， Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｍ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ ３ ′ ： Ｐ Ｃ ３ ５ ′ 。Ｐ Ｃ Ｒ程序为： ９ ５℃ ５ Ｃ Ｔ Ａ Ｈ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ ３ ′ ， ， ， ， 个循环 ９ ４℃ １ｍ ｉ ｎ ５ ０℃ １ｍ ｉ ｎ ７ ２℃ １ｍ ｉ ｎ ３ ０ ｍ ｉ ｎ 后７ 。Ｐ ２℃ 延 伸 １ ０ｍ ｉ ｎ Ｃ Ｒ产 物 的 回 收 纯 化 并 测
］ ７ ～ ９ 、 、 进行活菌计数， 计算存活率［ 。 １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
１ ２ 实验方法 分离培养方法： 本实验中， 运用 ８ １ ２ １ ２ ５ Ａ型厌氧 菌培养罐（ 沈阳市第五人民医院生产） 来进行厌氧菌 液体培养、 分离和稀释平板计数。丁酸梭菌的分离： ） 取酒窖窖泥样品 １ ， 加入到 ９ 置 １ ０ｇ ０ｍ Ｌ无菌水中， ， 杀死非芽孢菌， 转入梭菌增殖液 ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ 体培养基， 。２ ） 将上述培养液置 ３ ７℃厌氧培养 ４ ８ ｈ ， 转入梭菌选择性液体培养基， ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ ３ ７ 。３ ） 梯度稀释培养液， ℃厌氧选择性富集培养 ４ ８ ｈ 涂布梭菌选择性培养基平板， 置入厌氧培养罐， ３ ７ 。４ ） 影印好养和厌氧培养， 除去好氧和 ℃培养 ４ ８ ｈ 兼性厌氧菌， 得到严格厌氧菌。５ ） 选取培养特征、 菌 落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株