实验动物胚胎工程技术
动物胚胎工程的研究现状及在生产中的应用
动物胚胎工程的研究进展及在畜牧业中的应用摘要：动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术。
胚胎工程技术研究的目的，是对哺乳动物的胚胎在体外进行人为控制操作，让其继续发育，进而获得优良或珍稀动物个体，并应用这类技术进行基础研究和应用开发性研究。
近年来动物胚胎程技术发展迅速，并逐步在畜牧业中推广运用，显示出良好的应用前景。
关键词：胚胎工程；进展；胚胎移植；动物克隆；胚胎干细胞动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割、胚胎性别鉴定、胚胎冷冻保存、动物克隆和转基因动物等内容[1]。
目前，胚胎工程已在遗传学、医学、发育生物学、动物育种学上得到广泛应用。
将动物胚胎工程技术应用于畜牧业生产，取得了巨大的经济效益与社会效益。
一、动物胚胎工程技术的研究进展1、胚胎移植胚胎移植是胚胎工程的一项极其重要的基本技术，采用任何新技术所产生的胚胎，都必须通过胚胎移植才能得到后代。
科学家首先成功移植了兔胚胎，随后小鼠、大鼠及多种哺乳动物的胚胎移植试验相继获得了成功。
胚胎移植技术已被证实是奶牛繁育的一次重大变革，极大提高了优秀母牛的利用率，有利于产生更多优秀后备母牛和更多优质种公牛。
在现场条件下，奶牛的鲜胚移植妊娠率已达到60%～85%，冻胚移植妊娠率达50%～70%。
胚胎移植已在我国高技术研究和有关学科的基础研究中得到广泛的应用[2]。
2 、排卵控制排卵控制涉及排卵时间控制和排卵数量控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段的卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵[3]，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG和PGF2a及类似物。
在正常情况下，哺乳动物一次排卵数极其有限。
经超数排卵处理，排卵数则可增加数倍至10余倍。
因此，在生产上或科学试验中，通过超数排卵处理可获得大量胚胎[4]。
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点;掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿,记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199）,激素(PMSG和HCG)，石蜡油.2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1。
小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠.注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1—1)，以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时,再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位.皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG 后46h 利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上,鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部,或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上.图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠,在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部(图1—2）。
剪开腹膜,向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1—3）。
《胚胎工程实验技术》 讲义
《胚胎工程实验技术》讲义一、胚胎工程的概述胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
其目的是通过这些技术，对动物的生殖过程进行干预和调控，以获得人类所需的优良品种、生物制品或医疗手段。
胚胎工程是现代生物技术的重要组成部分，它在畜牧业、医学、生物学等领域都有着广泛的应用和重要的意义。
例如，在畜牧业中，通过胚胎移植技术，可以快速扩大优良种畜的种群；在医学领域，胚胎干细胞的研究为治疗多种疾病带来了希望。
二、胚胎工程的实验技术（一）体外受精技术体外受精是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
其主要步骤包括：1、卵母细胞的采集：可以通过从卵巢中直接采集、从已屠宰动物的卵巢中采集或借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
2、精子的采集和获能：采集的方法包括假阴道法、手握法和电刺激法等。
采集后的精子需要在体外经过获能处理，才能使精子具有受精能力。
3、受精：将成熟的卵子和获能的精子在适宜的培养液中共同培养一段时间，完成受精过程。
（二）胚胎移植技术胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
胚胎移植是胚胎工程中的最后一道“工序”，其基本程序包括：1、对供、受体的选择和处理：选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体。
对供、受体进行同期发情处理，使它们的生理条件达到同步或一致，以提高胚胎移植的成功率。
2、配种或进行人工授精：使供体发情排卵，进行自然交配或人工授精。
3、胚胎的收集、检查、培养或保存：配种或输精后第 7 天，用特制的冲卵装置，把供体子宫内的胚胎冲洗出来。
对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。
直接向受体移植或放入液氮中保存。
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
胚胎工程的基本流程
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第五讲胚胎工程ppt课件
实验动物的胚胎工程
• 胚胎工程(embryo biotechnology)是利用人工方法影 响、改变动物胚胎品质发育和进程的一种生物技术。
基本内容
• 超数排卵、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移 植、胚胎分割、性别鉴定、胚胎嵌合、细 胞核移植、体外受精、基因导入以及胚胎 干细胞
超数排卵
• 超数排卵是一种不正常的排卵，经外源激 素处理的雌性动物，改变其性周期，使之 按照预定时间超常量的排卵。
• 核移植技术在研究两个原核的作用，核质关系和加速繁殖优良实验动 物方面，将起着巨大的作用。
体外受精(in vitro fertilization, IVF)
• 体外受精技术是指通过人工操作使精子和 卵子在体外环境中完成受精过程的技术， 主要用于培育试管动物。体外受精技术为 遗传播种提供了新的选择，因为与体内受 精相比对正常精子的需求很少，从而提高 了具有性特征的精子利用率的可能性。
• 核移植是实现哺乳动物无性繁殖的重要手段，能产生遗传特性一致的 动物群，是培育超纯系实验动物的新途径和有效方法。
• 胚胎细胞核移植技术要比胚胎分割技术进了一步，它是用显微手术的 方法分离未着床的早期胚胎细胞，将其单个细胞导入去除染色体的未 受精的成熟的卵母细胞，经过电融合，让该卵母细胞质和导入的胚胎 细胞核融合、分裂、发育成胚胎。把该胚胎移植给受体，让其妊娠产 仔。目前知道的胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、 猪、牛和猴子等。
胚胎工程
专题3 胚胎工程 1概念、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
2、动物胚胎发育的基本过程（1）精子的发生：补充，精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂；变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。
[线粒体为精子运动提供能量] （2）卵子的发生：在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围]，减一分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精；减二分裂是在受精过程中完成的。
（3）受精：精子获能（在雌性动物生殖道内）；卵子的准备（排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力）；受精阶段[卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵黄膜]，a顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。
b透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障]；c卵细胞膜的封闭作用：精子外膜和卵黄膜融合，精子入卵后，卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障]；精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减二分裂，形成雌原核[注意：受精标志是第二极体的形成；受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。
（1）受精场所是母体的输卵管。
（2）胚胎发育：a卵裂期：细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加；b桑椹胚：32个细胞左右的胚胎[之前所有细胞都能发育成完整胚胎的潜能属全能细胞]；c囊胚：细胞开始分化，其中个体较大的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部逐渐出现囊胚腔[注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化]；d原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。
2023动物胚胎重点资料整理
名词解释（47个）1.胚胎工程（Embryos engineering）：是生物工程的一个分支，是动物生物工程的主干。
它是以胚胎移植为基础，通过人工操作胚胎，定向改变动物性状，使之为人类造福的一系列生物技术总称。
2.原始生殖细胞：是产生雄性和雌性生殖细胞的早期细胞,起源于原肠期胚胎的上胚层，细胞较大、呈碱性磷酸酶阳性。
3.精子发生：精子在曲细精管经多次分裂，产生特殊细胞，最终成为精子的过程。
4.精子顶体反应：指精子头部前端与卵子透明带接触以后，通过配体受体相互作用，顶体脂膜和顶体外膜的融合，顶体内小泡囊泡化，顶体内膜暴露，释放顶体酶熔蚀放射冠和透明带的过程。
5.卵子发生：由卵原细胞分化为成熟卵子的过程叫做卵子发生。
它包括三个时期：增殖期、生长期和成熟期。
6.受精：受精是两性配子相互融合，形成一个新的细胞——合子的过程。
它标志着胚胎发育的开始。
7.合子：（zygote）：有性生殖生物的雌雄配子结合后形成的新的细胞统称为合子。
高等生物卵式生殖所形成的合子又称为受精卵。
8.桑椹胚（Morula）：是指一个受精卵经过多次分裂，形成由32个左右细胞组成的细胞团。
其属于动物胚胎发育的早期阶段，里面的细胞还是全能细胞。
9.囊胚（blastula）：指的是内部产生囊胚液、囊胚腔的胚胎，囊胚中所有细胞都没有开始分化，这个阶段之后胚胎开始出现分化。
10.内细胞团（Inner cell mass，ICM）：是大多数真兽类哺乳动物在胚胎发生中的一个早期阶段，又称胚细胞（embryoblast）。
是一团位于初期胚胎中的一个细胞团块，也是最后将会发育成为胎儿的部位。
11.透明带反应：精、卵结合后，透明带的结构发生变化，阻止了其它精子穿越透明带，保证了正常的单精受精。
12.卵黄膜反应：当第一个精子进入卵黄膜之后,会引起卵黄膜的紧缩、增厚,阻止其他精子进入卵内与卵子结合受精13.生殖激素：直接作用于生殖活动，以调节生殖过程为主要生理功能的激素。
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3.超数排卵（Superovolation）技术：
通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物 卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十 几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。 所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素 (HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素 （PG）等，以前三种常用。
2018/11/23
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三、胚胎性别控制
性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要 的高新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动 物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物。
在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。 有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营 养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异 常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如 做胚胎性别鉴定，则可避免男性患儿的出生。
三、干细胞技术 四、外源基因导入技术
2018/11/23 2
胚胎工程的应用
1.畜牧业：通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体 外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎 移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。
2018/11/23
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2.生物制药：通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋 白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿 液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性 蛋白，用于预防和治疗某些人类的疾病。
2018/11/23
组织水平
1
胚胎工程（Embryonic engineering）又称胚胎技术,是指用工程学 的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要 动物的一系列生物技术的总称。
一、胚胎操作基本技术
1.超数排卵和卵母细胞、精子、受精卵的采集 2.体外受精 3.胚胎性别控制 4.胚胎分割 5.胚胎培养 6.胚胎移植 7.胚胎冷冻保存 二、体细胞克隆技术
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一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵
1.精子的采集
啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物处 死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠 的液滴，置培养液中培养。 大动物的精子采集可采用假阴道或电刺激法促进雄性射精，收集精液。
2018/11/23
正常人染色体
2018/11/23 16
具体的做法： • 先用DNA特异性染料对精 子进行活体染色，然后精 子连同少量稀释液逐个通 过激光束。探测器根据精 子的发光强度把电信号传 递给计算机，计算机指令 液滴充电使发光强度高的 液滴带正电，弱的带负电。 即X精子带上正电荷，Y精 子带上负电荷。当经过高 压电场时会向不同方向偏 转，达到分离的目的。
2018/11/23
10
注射PMSG
24小时
注射HCG
24小时
检查阴栓： 妊娠0.5天
20小时
受精卵 中午12时 中午12时 上午8时
放到种公鼠笼内 注射PMSG
24小时 24小时
注射HCG
15小时
采 集
卵母细胞 晚上5-6时 晚上5-6时
小鼠超数排卵程序
2018/11/23 11
二、体外受精
体外受精（ In vitro fertilization ）是指成熟精子与卵母细胞在体 外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵 母细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养 等。 体外受精（IVF）联合胚胎移植技术又称试管婴儿技术。
2018/11/23
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性别控制技术 1. 通过对X精子与Y精子分离以控制性别。 2. 在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控 制性别。 3. 通过控制饲料特性、受精环境如改变精液 或阴道的PH值等来控制性别。
2018/11/23
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（一）分离X精子与Y精子以控制性别
• 分离X精子与Y精子的依据： X、 Y精子在体积、密 度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在 差异。将 X和 Y精子分离再通过人工授精可以有效地 达到性别控制的目的。
第一节 概述
¤工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到 预想的目的。 ¤生物工程： 按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生 产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。 遗传（基因）工程 蛋白质工程 分子水平 酶工程 细胞工程 细胞水平 微生物工程 胚胎工程 组织工程
解剖取附睾尾部
精子的获取和培养
8
2.卵母细胞和受精卵的采集
从体内成熟并排到输卵管中去，需通过处死动物或外科手术获取卵母 细胞；如果在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。 取自屠宰淘汰的或刚死亡的雌性动物的卵巢，从卵巢中分离卵母细胞 经培养而得。
2018/11/23
小鼠解剖取输卵管
从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法 9
4.生命科学研究：阐明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等 基础理论。 5.拯救濒危野生动物：通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻 保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。
2018/11/23
5第二节胚胎操作基本术2018/11/23
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胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育
2018/11/23
2018/11/23
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（二）对胚胎进行鉴定以控制性别 • 在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体 检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。 其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、 快速的特点，近年来得到迅速的发展。 • Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY 基因(sex-determining region of Ychromosome,全称:Y染色体性别决定区)，为 胚胎性别鉴定提供了可靠的途径。
• 目前将X和 Y精子分离的方法有沉降法、电泳法、 免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分 离 X、 Y精子较准确的方法，具有重复性、科学性和 有效性的特点。
2018/11/23
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应用流式细胞仪分离X 和Y精子的原理：
• X精子的DNA含量比Y精 子的高。对于奶牛，X 精子比Y精子DNA含量 高3.8％，由于染料着 色量与精子DNA含量成 正比，因此X精子吸收 的染料多，发出的荧 光就比Y精子强。
已在乳腺表达的生物 活性蛋白并进入临床2 期或3期试验： 抗凝血酶一Ⅲ 抗胰蛋白酶 蛋白C 乳铁蛋白 乳糖酶
2018/11/23
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3.医学：通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以 及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通过对胚胎培养
和检测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生 优育的目的。