实验七 细胞骨架观察
细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架
细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架细胞骨架的免疫荧光标记及定位观察免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记并获得成功。
根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。
荧光素在一定条件下可与抗体分子结合同时不影响抗体免疫活性的特性。
用荧光抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原与标记抗体特异性结合，形成的免疫复合物固定于细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的可见物体，从而可以对抗原或抗体的性质进行定性、定量和定位分析。
常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。
免疫荧光的应用范围极其广泛，可以用于内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质的研究。
免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：存在非特异性染色，结果判定的客观性不足，步骤比较复杂。
免疫荧光分为直接法、间接法和补体结合法。
直接法：将荧光素直接偶联在一抗上，不需要二抗。
1.检查抗原法：这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。
此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
2.检查抗体法：将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。
间接法:先用未标记的特异抗体（一抗）与抗原结合，再用有荧光素标记的抗抗体（二抗，如抗IgG的抗体）与标本反应，样品中若有与一抗结合的抗原存在，则会形成抗原-抗体-抗抗体复合物从而达到染色的目的。
实验细胞骨架的显示及观察
实验细胞⾻架的显⽰及观察实验4 细胞⾻架的显⽰及观察姓名：李思露学号：131140040⼀、实验⽬的1.掌握⽤考马斯亮蓝R250染⾊观察动物和植物细胞⾻架的原理和⽅法。
2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和⽅法。
⼆、实验原理1.细胞⾻架：指真核细胞中的蛋⽩纤维⽹架体系。
⼴义的细胞⾻架包括细胞核⾻架、细胞质⾻架、细胞膜⾻架和细胞外基质。
狭义的细胞⾻架是指细胞质⾻架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated filament，IF）。
2.微管微管是细胞内由微管蛋⽩形成的直径约呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。
微管蛋⽩有α和β两种。
αβ异⼆聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。
微管不稳定，对低温（冷冻）、⾼压等物理因素及秋⽔仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。
紫杉醇可以和微管蛋⽩多聚体结合，抑制微管解聚。
3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋⽩（actin）组成的直径为5～7nm的⾻架纤丝。
主要分布在细胞质膜的内侧，作⽤是确定细胞表⾯特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。
脊椎动物肌动蛋⽩分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋⽩组成不同。
肌动蛋⽩单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋⽩链互相缠绕扭曲成⼀股微丝。
细胞松弛素B为微丝断裂剂。
4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋⽩组成的细胞⾻架（1）了解细胞⾻架与细胞各种功能⾏使之间的关系。
（2）了解理化因素是否通过影响细胞⾻架对细胞功能产⽣影响，以便趋利避害。
（3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。
6. 显⽰细胞⾻架的常⽤⽅法：考马⽒亮蓝染⾊法、免疫荧光染⾊法、⿁笔环肽标记法。
（1）考马斯亮蓝染⾊法原理及特点原理：⽤去垢剂Triton X-100处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与⼤部分⾮⾻架蛋⽩疏⽔区结合⽽将其溶解，剩下的纤维状细胞⾻架蛋⽩⽐较稳定⽽不被溶解，然后⽤蛋⽩染料考马斯亮蓝染⾊即可显⽰其结构。
细胞骨架实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解细胞骨架的基本概念及其在细胞生物学中的重要性。
2. 掌握使用荧光显微镜观察细胞骨架的方法和技巧。
3. 认识细胞骨架的主要组成成分，包括微丝、微管和中间纤维。
4. 分析细胞骨架在不同细胞类型和生理状态下的形态和分布。
二、实验原理细胞骨架是真核细胞内由微丝、微管和中间纤维组成的网状结构，负责维持细胞形态、细胞运动、物质运输、信号传导等重要功能。
微丝主要由肌动蛋白组成，微管主要由α-和β-微管蛋白组成，而中间纤维则由多种蛋白质组成。
细胞骨架的结构和动态变化对细胞的正常生理功能至关重要。
三、实验材料与仪器材料：1. 植物细胞样本（如洋葱鳞片叶表皮细胞）2. 动物细胞样本（如小鼠成纤维细胞）3. 荧光标记的细胞骨架蛋白抗体4. 抗荧光标记的抗体5. 胶体金标记的抗体6. 封片剂仪器：1. 荧光显微镜2. 激光共聚焦显微镜3. 冷冻切片机4. 液氮5. 恒温培养箱6. 电子显微镜四、实验步骤1. 样本制备：- 植物细胞样本：取洋葱鳞片叶表皮细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。
- 动物细胞样本：培养小鼠成纤维细胞，用2%的戊二醛固定，进行冷冻切片。
2. 荧光标记：- 将切片置于含有荧光标记的细胞骨架蛋白抗体的溶液中，室温孵育一段时间。
- 洗涤切片，去除未结合的抗体。
3. 抗荧光标记抗体：- 将切片置于含有抗荧光标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。
- 洗涤切片，去除未结合的抗体。
4. 胶体金标记抗体：- 将切片置于含有胶体金标记抗体的溶液中，室温孵育一段时间。
- 洗涤切片，去除未结合的抗体。
5. 封片：- 将切片置于封片剂中，覆盖玻片，封片。
6. 显微镜观察：- 使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的形态和分布。
五、实验结果与分析1. 洋葱鳞片叶表皮细胞：- 在荧光显微镜下观察到洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架主要由微丝和微管组成。
- 微丝呈网状分布，主要位于细胞质膜内侧。
- 微管呈束状分布，主要位于细胞核周围。
实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R染植物细胞的微丝
考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝
Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用： 非离子去垢剂
适当浓度的Triton X-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细 胞质中的细胞骨架系统可被保存； M－缓冲液 和磷酸缓冲液作用:
清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压； EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：
洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果 洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数10×20）
左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层
前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是 高浓度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度； 戊二醛作用：
良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态； 考马斯亮兰作用：
非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。
实验的关键：
Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如 果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白， 会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察； 如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维 断裂。
一、实验目的
掌握观察植物细胞内微丝的方法。 了解观察动物细胞内微丝的方法。
二、实验原理
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构， 安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和 中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、 运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1％ Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细 胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰 R250染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见。
盐溶液（PBS，pH6.8），
0.2％考马斯
细胞骨架实验报告分析
细胞骨架实验报告分析
实验目的：分析细胞骨架的结构和功能。
实验方案：
1. 从培养皿中取出细胞样本。
2. 用PBS缓冲液洗涤样本，去除杂质。
3. 采用适当的方法对细胞样本进行固定，如使用甲醛或冷冻固定法。
4. 进行细胞透明化处理，如使用醋酸正己酯或醋酸乙腈进行处理。
5. 使用荧光染料标记细胞骨架，如荧光标记的抗体。
6. 进行显微观察，使用显微镜观察细胞骨架的形态和结构，并记录观察结果。
7. 分析细胞骨架的组成和功能。
实验结果：
观察细胞骨架后，我们发现细胞骨架主要由微观结构组成，包括微丝、微管和中间丝。
微观结构在细胞内起着维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂等重要功能。
微丝由细胞骨架蛋白聚合体组成，主要存在于细胞质中。
微丝的直径约为7纳米，长度可变。
微丝在细胞运动、肌肉收缩等方面起到重要作用。
微管由微管蛋白聚合物组成，是一种管状结构。
微管的直径约为25纳米。
微管在细胞分裂、细胞内物质运输等过程中起到
重要作用。
中间丝是由中间丝蛋白聚合物组成的，直径约为10纳米。
中间丝在细胞内提供机械支持，使细胞具有较强的抗压性。
实验结论：
细胞骨架是细胞内的重要组成部分，对维持细胞形态、细胞运动和细胞分裂等过程起着重要作用。
细胞骨架的主要组成包括微丝、微管和中间丝，它们通过不同的机制实现细胞的各种功能。
对于进一步研究细胞活动、细胞生物学和生物医学领域的研究具有重要意义。
细胞骨架的观察
实验结果
动物细胞微丝束
于培养皿中，加入pH6.8磷酸缓冲液,没过表皮即 可，放置约1-2min； 吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理 30min； 吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次 3min； 3%戊二醛固定30min； pH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次3min； 0.2%考马斯亮蓝R250染色10min； 用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺于载玻片上， 加盖玻片，于显微镜下观察。
用适当浓度的tritonx100处理时可将细胞内蛋白质破坏但细胞骨架系统的蛋白质却被保存后者用考马斯亮蓝r250染色可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构
植物细胞骨架的光学
显微镜观察
实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色 方法。 实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理 时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架 系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮 蓝R250染色，可在光学显微镜下观察到细 胞骨架的网状结构。
实验试剂：
1、M-缓冲液； 2、pH6.8磷酸缓冲液； 3、1% Tritபைடு நூலகம்nX-100，用M-缓冲液配制； 4、0.2%考马斯亮兰R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液配制；
实验步骤：
1. 撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若干片，置
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实验七 植物细胞骨架的观察
Expression pattern of a GFP fusion to the peroxisomal multifunctional protein (MFP) in onion epidermal cells. microtubule binding activity of MFP in the cytosol The punctate structures represent peroxisomes, and the filamentous structures are microtubules. Inset is a confocal image (using Openlab software) showing a smaller region of a GFP-MFP expressing cell. Bars, 20 µm and 3 µm (inset). Modified from BMC Cell Biology 2005, 6:40 .
Nature 408,423(2000)
实验用品
1. 材料：新鲜洋葱鳞茎(叶)的内表皮
2.试剂
0.01Mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS） M－缓冲液 1％Triton X-100（用M-缓冲液配） 0.2%考马斯亮蓝R250 3%戊二醛-PB溶液（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种 细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些 细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些 类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到 的主要是微丝组成的张力纤维。张力纤维形态长而直，常常 与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。
细胞骨架的观察PPT学习教案
细胞结构，抽提时间短背景干扰大。 • 甲基罗丹明—鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。
在没有固定液3.7%甲醛—PEMD的情况下，也可以用-20℃冷甲醇 代替，但是效果较差。 • 细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变 圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。 • 每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的 抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。
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2.实验材料 、用品
•
实验材料：培养的Hela细胞
•
实验用品：
①实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型 振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻 片，盖玻片，铝盒等。
②主要试剂
M—缓冲液，1%Triton X—100（用M—缓冲液配制），0.2%考 马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。
• 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速 等优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其 它技术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。
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细胞骨架研究中常用药物
药物名称 作用
细胞松弛素B (cytochalasin B, CB)
结合在微丝的正端，阻抑其聚合， 同时提高临界浓度，最终导致微 丝的解聚
强烈亲和微丝，结合在微丝中 actin亚单位之间，稳定微丝、促 进微丝聚合 阻断微管蛋白组装成微管 促进微管的装配，稳定已形成的 微管
鬼笔环肽 (phalloidine) 秋水仙素（colchicine） 紫杉醇（taxol）
片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。
注意盖玻片的正反面
切勿产生气泡！
37℃预温 PEM洗数3次 避光操作
滴加10L Ho.33342复染色
荧光镜下观察
注意事项
注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 荧光观察注意避光操作 节约试剂。
思考题
PEM缓冲液的作用是什么？ 0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？
•用小砂轮切去
长方形盖玻片的 一角作为标记以 便识别细胞面。
取出盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)
•细胞密度6080%
Triton X-100处理约10min(1mL) 37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) 37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL) 37℃预温 PEM洗3次 55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温 染色30min。 在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻
蛋白和抗体的 FITC 494/518 绿色荧光 耦联探针
Texas red 595/615 红色荧 光
染死细胞,对PH值变化不敏感 多参量细胞标记 探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细 胞器 可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭 快,无毒性
溶酶体 线粒体
Neutral red 541/640 红色 荧光 Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光
实验原理
鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒 生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结 合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合 后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的 动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因 而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度 的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微 丝并不是用于研究活体细胞的理想方法.
细胞骨架组分的 荧光染色观察
实验目的 掌握细胞骨架的显示方法 掌握荧光显微镜的使用方法 了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构
背景知识
常用荧光探针介绍
细胞参量 DNA和RNA 荧光探针 吸收/发射 nm
Propidum iodide(PI) 535/617 红色荧光 Ethidium bromide(EB)518/605 红色荧光 DAPI 358/461 蓝色荧光
细胞骨架
狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架 和细胞外基质。
微管
2014-11-17
ห้องสมุดไป่ตู้丝
2014-11-17
中间纤维
2014-11-17
背景知识
S.D.Pone 用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨 架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞 为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的 triton X -100 溶液（聚乙二醇辛 基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构 中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容 易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝 组成的纤维束。
特性
嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色 体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳 分析,染色体观察
半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细 胞周期的研究,染色体和细胞核的观察
Hoechst33342 350/461 蓝 结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于 细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 色荧光
ATP、 Mg2+、高K+、Na+
G-actin
Ca2+、低Na+、K+
F-actin
实验步骤
材料：
CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 试剂： 1.PEM ： 50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。