农杆菌花序侵染法转化拟南芥
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。
由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。
农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。
转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。
待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。
与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。
图 1. 拟南芥蘸花法简要过程（2）。
拟南芥瞬时转化常用的有农杆菌介导的叶片转化、基因枪轰击和聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化等方法。
拟南芥的瞬时转化为研究启动子活性、蛋白的亚细胞定位和蛋白相互作用等提供了支撑。
参考文献：Ghedira R.; et al.(2013) The ef f iciency of Arabidopsis thaliana f loral dip transf ormation isdetermined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotypeof the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.Zhang, X.; et al.(2006). Agrobacterium-mediated transf ormation of Arabidopsis thaliana using thef loral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.。
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的
第32卷第2期2013年2月绵阳师范学院学报Journal of Mianyang Normal University Vol．32No．2Feb．，2013收稿日期：2012-12-30基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009－091B ），国家自然科学基金（30871555），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET －08－0940），四川省教育厅（09ZA034）、西南科技大学博士研究基金（11zx7104）和农业部公益性行业科研专项（201103007）作者简介：张思维，硕士研究生，主要从事植物遗传与抗逆研究*通讯作者：代其林，博士，副教授，研究方向为植物遗传与抗逆研究．E －mail ：daiqilinmj@．sina．com农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究张思维，周文波，张新，陈翠娜，代其林*（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621000）摘要：耐辐射奇球菌(D．radiodurans ，DR )在极端胁迫条件下能够继续生存，其耐辐射奇球菌基因组中(DRR1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究．DR 1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因，其蛋白序列存在一个Why 功能域，此功能域可能参与了植物的抗旱过程．我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372－GV3103表达载体，然后利用花序浸染法成功将目的基因DR 1372转入拟南芥中，最后对阳性植株进行盐胁迫，证实了DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．初步建立了农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥体系，为后续DR 1372基因的功能研究工作提供了理论基础．关键词：DR 1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥中图分类号：O175.12文献标识码：A 文章编号：1672-612x （2013）02-0057-080引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性．按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类：第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因；第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］．Pibn －Smits 等将otsA 和otsB 导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］．Kishor 等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS 基因与CaMV35S 启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍；干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］．Capell 等发现Adc 在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］．由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB 、MYC /MYB 、bZIP 、WRKY 和NAC 类等，其中MYB /MYC 是植物中最大的转录因子家族．Chen 等发现了小麦中23个MYB 转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］．耐辐射奇球菌（D．radiodurans ，DR ）是Anderson 等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA 损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］．White 等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］．DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA 修复，DNA 损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能．Battista 等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］．DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因．对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy 功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy 功能域结构非常相似［9］．WHy 结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N 末端都存在一个非蛋白氮（NPN ）结构．同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy 功能域的存在，最终推测WHy 结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］．脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy 功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA 、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］．由于WHy 功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR 1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因．因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR 1372－GV3103表达载体，将DR 1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR 1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR 1372的功能研究包括WHy 功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义．1实验材料1．1植物材料拟南芥野生型col －0生态型1．2菌株DR 1372+Z3（DR 菌内与干旱相关的基因DR 1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌），JM109，JM109，GV31032实验方法2．1构建DR 1372－GV3103植物表达载体2．1．1DR 1372基因的引物设计根据DR 1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物（分别命名为DR 1372－F ，DR 1372－R ）；根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI ，SacI 限制性酶切位点，并设计引物如下：Sence ：5＇－－－－－－GC TCTAGA ATGAAGAAGATGGCTTTTGCG －－－－－3＇Antisence ：5＇－－－CG AGCTC TCAAAACACCGATAAAGGCGC －－－－3＇（加粗标记示酶切位点）2．1．2PCR 扩增目的基因DR 1372用试剂盒（TIANGEN ）提取DR 1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR 扩增．电泳验证．2．1．3质粒pBI121的提取用试剂盒（TIANGEN ）提取pBI121质粒．电泳验证．2．1．4PCR 产物胶回收PCR 产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（TIANGEN ）回收扩增的目的片段DR1372和pBI121．电泳验证．2．1．5DR 1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2．1．5．1目的片段DR 1372和pBI121质粒用XbaI ，SacI （购自Takara 公司）进行双酶切，37ħ酶切过夜，回收目的片段．2．1．5．2将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16ħ连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞．2．1．5．3阳性克隆检测：进行菌落PCR 初步鉴定，将PCR 检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序．2．1．6挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌．将保存菌种摇菌提取质粒，得到DR 1372－GV3103植物表达载体．2．2花序浸染法转化拟南芥2．2．1培养基：MS 培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素（Kan ，50mg /ml ）Hoagland＇s （霍格兰氏）液体培养基药品试剂：乙酰丁香酮（AS ）Silwet －L77表面活性剂2．2．2拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1min ，然后用无菌水洗2遍；再用2．5%NaClO 消毒5min ，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4ħ冰箱春化2d 后进行铺板．·85·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）铺板前一天按照每板大约25mL MS 配制固体平板培养基，col －0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中（22ħ，16h /8h 光/暗培养（光强130μmol ·m －2·s －1））．培养10d 后把拟南芥幼苗移栽至培养土中（营养土/蛭石=2：1），相同温度和光照条件下继续培养，每3d 浇水一次．待拟南芥开出花序准备进行浸染．2．2．3花序浸染法浸染拟南芥：2．2．3．1DR 1372－GV3103农杆菌的培养：在200mL LB 液体培养基中加入0．2mL DR 1372－GV3103菌液，28ħ220rpm 振荡培养15h 左右，室温下4000rpm 离心20min ，弃上清，用1/2MS 液体培养基（含AS 100μmol /L ，0．05%Silwet －L77表面活性剂）悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28ħ220rpm 振荡培养1h ，菌液浓度达到OD 600=0．5时待用．2．2．3．2浸染：将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5s ，倒放24h ，并用薄膜覆盖避光24h ，然后21ħ光照培养．2．2．4收取拟南芥的T 1代种子：T 1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR 鉴定，阳性T 1代幼苗开花结实后，收取T 2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子．2．3转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2．3．1拟南芥种子的消毒、铺板选取T 2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1min ，用无菌水洗2遍；再用2．5﹪NaClO 消毒5min ，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4ħ冰箱进行春化处理2d．然后把春化后的种子铺在25mL MS 固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养（22ħ，16/8h 光/暗培养（光强为130μmol ·m －2·s －1））．2．3．2对拟南芥幼苗进行NaCl 盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300mmol /L 灭菌的NaCl 溶液．然后观察拟南芥幼苗的生长状况．3结果3．1pBI121－DR 1372质粒的构建3．1．1提取含DR 1372基因质粒提取DR 1372质粒，其电泳结果如图A 所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR 扩增．3．1．2DR 1372基因的扩增利用DR 1372－F 和DR 1372－R 引物对DR 1372基因进行PCR 扩增，其电泳结果如图B．DR 1372基因分子大小为495bp ，条带位置正确，并且为单一条带．然后对PCR 产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C．3．1．3pBI121质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D 所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切．3．1．4对DR 1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI ，SacI ，经电泳后（图E ）再胶回收（图F ）．同时对pBI121质粒进行XbaI ，SacI 双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G 和图H．从图G 和图H 两个电泳图分析表明：经双酶切后，目的基因DR 1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR 1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化．3．1．5连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR 扩增，其扩增的部分结果如图I ，表明：有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR 1372序列完全一致，说明DR 1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109．·95·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图1pBI121－1372质粒的构建结果Fig．1pBI121－DR 1372clone in JM109A －I 中M 为DL2000MarkerA ：DR 1372+Z3质粒电泳条带A ：Agar gel electrophoresis of DR 1372B ：DR 1372扩增条带B ：Agar gel electrophoresis of PCR productC ：DR 1372PCR 胶回收验证C ：Agar gel electrophoresis of DNA extractionD ：pBI121质粒提取验证D ：Agar gel electrophoresis of pBI121E ：DR 1372双酶切电泳图E ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested productsF ：DR 1372双酶切后胶回收电泳图F ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested products ，extractionG ：pBI121双酶切电泳图G ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested productsH ：pBI121双酶切胶回收验证H ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested products ，extractionI ：JM109菌落PCR 验证I ：1：positive control ；2：negative control ；3－10：PCR products of JM109with pBI121－DR 1372clone3．2DR 1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR 验证，结果如图2．由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66．67%．图2DR1372－GV3103的菌落PCRFig．2Analysis of DR1372－GV3103M ：DL2000maker ，9：阳性对照，10：阴性对照，1－8：单克隆菌落PCRM ：DL2000Marker ；9：positive control ；10：negative control ；1－8：PCR products of GV3103with pBI121－DR 1372clone ·06·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）3．3转DR 1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3．3．1转DR 1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子（浸染到收取种子的过程如图3所示）．将收取的种子用50mmol /L 卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA ，进行PCR 检测，然后得到10株转DR 1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T 1代种子．对T 1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T 2代，T 2代得到阳性苗60株，经PCR 检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36．7%．3．3．2阳性植株的PCR 检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA ，进行PCR 扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp 大小的扩增条带，说明外源DR 1372基因成功转入到野生型拟南芥中．图3转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig．3Regeneration of transgenic ArabidopsisA ：花序浸染后拟南芥B ：50MKan 筛选T 1代抗性苗C ：T 1带抗性拟南芥幼苗D ：T 1抗性拟南芥代成株子E ：筛选T 2代抗性苗F ：T 2代抗性拟南芥幼苗G ：T 2代抗性拟南芥成株A ：the impregnated ArabidopsisB ：resistant shoots of T 1generationC ：T 1generation Arabidopsis seedlingD ：the mature plant of T 1generationE ：resistant shoots of T 2generationF ：T 2generation Arabidopsis seedlingG ：the mature plant of T 2generation·16·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图4转DR 1372基因拟南芥PCR 检测Fig．4PCR test of DR 1372gene in transgenic plantsM ：DL2000maker ；1：阳性对照；14：阴性对照（野生型）；2－13：抗性植株M ：maker ；1：positive control ；14：Negative controls （WT ）；2－13：Transformed plants3．4转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR 1372基因拟南芥T 2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300mmol /L 的NaCl 溶液．NaCl 胁迫7d 后，转DR 1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别（如图5）．当NaCL 胁迫浓度为100mmol /L 时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响；当NaCL 浓度达到200mmol /L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化；当NaCL 浓度达到250mmol /L 时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重；当NaCL 浓度达到300mmol /L 时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR 1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境．图5转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig．5Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlingstreated with different concentrentions of NaCL·26·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）4讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力．其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］．DR 1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域．Francesca D 、Ciccarelli 、Peer Bork ［9］等人研究表明，WHy 结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能．WHy 功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy 功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究．对转化了DR 1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强．由此推断，将DR 1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响．拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用．本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR 1372转入了拟南芥基因组中．实验中构建了DR 1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS 基因，以及CaMV35S 强启动子和NOS 终止子，能够稳定调控DR 1372基因在植物中的表达．利用冻融法将植物表达载体DR 1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR 1372整合到拟南芥．对DR 1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL 浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR 1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300mmol /L 时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．本实验通过基因工程手段，成功得到转DR 1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据．参考文献：［1］李晓慧，董明伟，刘康．植物抗旱基因及其功能研究进展［J ］．江苏农业科学，2009，5（4）：73－77．［2］Pilon －Smits E A H ，Ebskamp M J M ，Paul M J ，et al．Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco un-der drought stress ［J ］．Plant Phyiol ，1995，107：125－130．［3］Kishor P B K ，Hong Z ，M iao G ，Hu C A ，et al．Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline productionand confersosmotolerance in transgenic plants ［J ］．Plant Physiol ，1995，108：1367－1394．［4］Capell T ，Escobar C ，Liu H ，et al．Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normaldevelopment patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J ］．Theor Appl Genetics ，1998，97：246－254．［5］Chen J．and Wang Z．Y．Progress in the study of plant mybtranscription factors ，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao（Journal of Plant Physiology andMolecular Biology ），2002，28（2）：81－88．［6］Anderson ，A．W ，Nordon ，H．C 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1372Gene into Arabidopsis thalianaZHANG Si －wei ，ZHOU Wen －bo ，ZHANG xin ，CHEN Cui －na ，DAI Qi －lin *（School of Life Science and Engineering ，Southwest University of Scienceand Technology ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：DR 1372is cloned from an extremely radiation resistant bacterium which named D．radiodurans．It contains a special domain called Why which may be involved in the mechanism of drought resistance of plants．In this study ，the plant expression vector DR 1372－GV 3103was firstly constructed and DR 1372gene was inserted into Arabidopsis successfully by using the transgenic technique．Then ，positive plants have got a salt stress and the results show that DR 1372gene improves the salt tolerance of Arabidopsis obviously．Thus ，it not only contributes good conditions to later research on DR 1372gene ，but also has great important application in plant gene engineer-ing technology．Key words ：DR 1372；Construction of express vector ；Salt stress ；Arabidopsis thaliana（上接第50页）On Extractives from Natural HerbsUsed in Functional CosmeticsHU Li －chuan 1，MEI Shuang 1，YANG Tong －xiu 1，CHEN Lang 2，YU Zong －lan 2，Guo Ting －ting 2，CHEN Ying 1（1．School of Chemistry ＆Chemical Engineering ，2．School of Life Science and Technology ，Mianyang Normal University ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：This paper is to introduce a new paste functional cosmetic and a percutaneous absorption acne patch with competence of essential oil from wormwood and artemisia apiacea ，their physicochemical index ，antimi-crobial effect ，pox －eliminating effect have been tested ，and the results are as follow ，these two have good stabili-ty ，compatibility ，anti －bacterial activity ，and certain pox －eliminating effect．Key words ：Wormwood ；artemisia apiacea ；essential oil ；cosmetic ；anti －bacterial activity ·46·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥作者：刘慧娟，冯志国，李先文，等来源：《湖北农业科学》 2013年第1期刘慧娟１，２，冯志国１，２，李先文1，李涛２，３，何光源２（１．信阳师范学院生命科学学院，河南信阳４６４０００；２．华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４；３．重庆警察学院，重庆４０１３３１）摘要：利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ转入拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ中，共获得了１４株转基因系，并进行了转基因拟南芥种子萌发实验。
结果表明ｔｐ－ｃｒｔＢ基因已经成功转入拟南芥中，其不影响拟南芥种子的正常萌发。
关键词：ｃｒｔＢ基因；农杆菌花序浸染法；拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中图分类号：Ｑ９４３．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０13）01－0200-03类胡萝卜素（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）是一种在自然界中分布广泛、种类丰富的色素，导致许多植物的果实、花及块根呈现橙红色、黄色或红色。
类胡萝卜素对动物、植物、藻类、细菌以及真菌细胞都是不可缺少的营养成分。
植物类胡萝卜素还是植物激素［１］、防御化合物［２］和风味芳香物（如β－吲哚）［３］等许多生理活性物质生物合成的前体。
噬夏孢欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）类胡萝卜素合成相关基因ｃｒｔＢ编码的八氢番茄红素合成酶是催化类胡萝卜素合成的关键酶和限速酶。
为了研究该酶对类胡萝卜素合成的调控作用，构建了特异性表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ，通过农杆菌花序浸染法将其转入拟南芥，获得转ｃｒｔＢ基因拟南芥植株，为分析ｃｒｔＢ基因的过量表达对拟南芥生长发育的影响奠定基础。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α、根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５及ｐＢｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔＫＳ、植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｎａｐＡ均为华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室保存。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
农杆菌侵染拟南芥
拟南芥侵染方法：
1、取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜
至培养基由红色转为黄色。
2、将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min
3、弃上清，加入50ml 1／2 MS，将菌泥搅起
4、将培养4周左右,刚开花的拟南芥植株上的果荚去除，将上面准备好的菌液倒入培养皿
中，将整个花序浸入菌液10sec
5、将浸好的拟南芥植株在黑暗条件下，处理18-24h后继续光照，一周后可再dip一次
用于Dip的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2 MS平板上。
4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。
16\8 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
营养土产家：吉林省德惠市芳洁花土厂(花卉营养土) 我们是从北京际翔园艺花圃公司买的。
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农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、
L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。