神经细胞体外培养方法及应用 ppt课件
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经细胞培养讲义课件
合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
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常用的平衡盐溶液（g/L）
R in g e r
PBS
(1 9 8 5 )
E a rg le (1 9 4 8 )
H anks (1 9 4 9
D u lb e c c o (1 9 5 4 )
b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃
b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4
c 渗透压：260~320m
mol/L
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3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！
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三、培养操作过程
• 新生1～3d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净
工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥 除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中
•剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min，
Байду номын сангаас
•用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min，
2 细胞系培养
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一 神经元的原代培养(Primary culture)
一、组织来源：
1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期
神经干细胞及其在神经系统疾病中的应用 PPT课件
神经干细胞的研究历史
传统观点：
神经细胞是永久性细胞，是不可 能分裂的。神经细胞损伤后由神经胶 质增生进行修复。这种观点使人们对 帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤 等疾病的治疗受到了很大的限制。
早在20世纪60年代，Altman用同 位素标记的胸腺嘧啶掺入脑中，发现 在新皮质、海马、嗅球的细胞有同位 素掺入，证明这些区域有能分裂的细 胞存在。但是，由于当时的条件无法 进行活体追踪，体外培养也未能建立， 因此传统的观点一直占优势。这应该 是对神经干细胞最早的研究。
3，具有很强的分裂增殖能力。
4，对损伤和疾病具有反应能力。
5，免疫特性：表达成神经上皮细胞标记 Nestin,Notch1,EGFR,FGFR(不表达NSE,GFAP,NF)
6，神经干细胞通过两种方式生长 ,一种是对 称分裂 ,形成两个相同的神经干细胞 ;另一种是非 对称分裂 ,由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的 分配 ,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而 成为功能专一的分化细胞 ,另一个子细胞则保持亲 代的特征 ,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞 的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。
总之，在动物和人类的神经系统 中，从胚胎时期到成年时期均存在着 神经干细胞。
神经干细胞的特点
神经干细胞具有以下特点：
1，具有多种分化潜能，即分化为神经组织 的各种细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶 质细胞（专能干细胞、多能干细胞）。
2，具有自我更新的能力，所谓自我更新，指 将干细胞的属性从亲代传递到子代细胞，即在分裂 增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞的属性（亲代 干细胞和子代干细胞）。
神经干细胞及其在神经 系统疾病中的应用
神经干细胞的概念
《神经培养技术》PPT课件
神经培养的发展历史
➢萌芽：1885年德国学者Roux将鸡胚的神经 板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内 存活数天。
➢起步：1907年，Harrison首次成功地用蛙 淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神 经细胞突起的生长过程。
➢发展：在设备、条件和方法上不断改进， 尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发 展的阶段。
原代培养（primary culture）：神经细胞一 般不再分裂，不传代，故属原代培养。 再培养（sub-culture）：把培养物切、割、 取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。 联合培养（coculture）：把两种或两种以上 的组织放在一起进行培养。
四、其它
按开创研究者的名字命名，如Maximow 双盖片法。
《神经培养技术》PPT课 件
简介
体外培养（in vitro culture）包括：
组织培养（tissue culture） 细胞培养（cell culture） 器官培养（organ culture）
就是将活体结构成分（如活体组织、细 胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出， 放在类似于体内生存环境的体外环境中，让 其生长和发育的方法。
2. 生长附加成分 比较通用的： 胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺
（丁二胺） B-27、N-2（Gibco）
全培液
以下各种成分各10 ml配制成全配 液40 ml（葡萄糖含量为6g/L）： 1. 胎牛血清 2. DMEM 3. 九天鸡胚渗出液 4. Glucose/BSS（5%葡萄糖溶液 4.7 ml， Tyrode’s BSS 5.3 ml）
低限量 Eagle培养基
DMEM：Dulbecco’s Modified Eagle Medium
细胞培养技术17577PPT课件
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整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1，如下图所示：
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细胞生长曲线
体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传 代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细 胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、 细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增 加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞 系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多 时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经 过以下三个阶段：
凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质 边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触 区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中
②胞膜出芽或起泡 ③细胞皱缩；
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3、保持胞浆细胞器完整性
扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，① 线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网 （SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有 时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞 表面平行的微丝束。
取材 无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的
而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等） 后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后 应尽快培养，因故不能马上培养时，置4℃的培养 液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严 格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。 取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌， 为减少污染，可用500～1000单位/ml青、链霉素 的PBS液漂洗5～10min。 （无论是传代培养还是原代，对细胞进行操作切 记：细心，专心，动作要轻）
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神经细胞的培养
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细胞培养的基本条件
超净工作台的使用
使用前： 开启柜内紫外灯照射10~30min； 预工作2~3min，以除去臭氧和使工 作台面、空间呈净化状态。 使用完毕后： 要用70%酒精将台面和台内擦拭干净。
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细胞培养的基本条件
火焰消毒
在无菌环境下培养时，首先要点燃酒精灯 ，以后的一切操作，如打开或封闭瓶口等 ，都需在火焰近处并经过烧灼。 注意事项：塑料和橡胶制品过火时要快速 ，不能长时间烧灼。
2.不能用手触及消毒器皿的工作部分， 工作台面上用品要布局合理 。 3.瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 4.吸溶液的吸管不能混用。 。
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细胞培养的基本概念
传代培养注意事项
5.接种数量一般为5x104~8x105个 /ml。
6.传代密度太低，细胞容易死亡，表现 出细胞在达到增殖前有较长的滞留期。 7.培养液由于pH下降呈黄色，若无污 染需要换液或传代。
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细胞培养的基本条件
细胞培养的实验用品
细胞培养瓶：25cm2，75cm2，150cm2
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细胞培养的基本条件
细胞培养板：6孔、12孔、24孔、48孔和96 孔（包括平底、U型和V型）。
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三、细胞培养的基本条件
无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件
神经干细胞再生与体外培养的实验研究
神经干细胞再生与体外培养的实验研究近年来，神经系统疾病已成为世界范围内重要的健康问题之一。
例如，阿尔茨海默病、帕金森氏症和脊髓损伤等疾病，对患者日常生活造成了严重的影响。
虽然目前有许多药物和治疗方法，但是很难完全治愈这些疾病，于是，神经干细胞再生的实验研究成为治愈神经系统疾病的一个新方向。
神经干细胞是一种具有自我更新和多线分化潜能的细胞。
这些干细胞能够分化成各种类型的神经细胞，包括神经元（神经细胞）和神经胶质细胞（支持细胞），并且有望重建损伤的神经组织。
具有自我更新潜力的神经干细胞可以通过细胞分裂不断产生更多的神经干细胞。
而分化潜力可以让神经干细胞，根据特定环境信号分化成一定类型的神经细胞。
在实验室中，神经干细胞的繁殖和分化可以通过体外培养来实现。
体外培养是指将细胞从其体内环境中分离出来，然后将其放置在好氧、无菌的环境中，加入一定的营养因子和细胞因子，提供良好的培养条件，使其生长、分裂，发挥其自我更新和多向分化的能力。
对于神经干细胞的体外培养，关键是要选择一种可以维持其自我更新和多向分化潜能的培养基。
目前，文化基础通常包括一种有机物，如人工合成物MS5和培养基B27，以及一种因子交联的蛋白质或培养基因治疗。
这些因子可以提供正确的信号和良好的环境，激活神经干细胞的分裂和分化。
另外，神经干细胞在培养时，还需要种植在一种支持细胞或未分化的神经细胞上，以提供必要的生长因子和支持。
在干细胞培养和分化的过程中，各种因素的运用互相协作，最终实现了神经干细胞的分化成为神经元和神经胶质细胞。
神经干细胞的再生研究，也可以辅助治疗神经系统疾病。
例如，通过研究神经干细胞在修复损伤后的体外和体内表现，社会上已经能够开发出一些神经干细胞的移植技术。
但是，目前这种技术的应用还面临一系列问题。
例如如何均等的种植神经干细胞、如何让其更好的定位和分化、如何减少免疫抑制剂和避免移植后的排异反应，以及如何克服治疗效果的耐受性等。
随着技术的进步，这些问题的解决将极大地推动神经干细胞和再生医学的发展。
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液条件。
Bottenstein实验室经过长期研究发 现如下添加剂比较好
人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺 加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清 添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细 胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神 经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列 出了三种神经元限定性培养添加物的配方， 代号分别为N1、N2、N3。
舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液
370C，30min
舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液
用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次
若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打
将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向 沉淀加培养液，离心1200r/min，8min
入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍。 剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去残血 加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水
370C浴箱中消化20-25分钟。 终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。吹打
制成细胞悬液。 台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。 370C 5%CO2培养2天后换生长培养液
N1的配方为
胰岛素5μg/ml 转铁蛋白5μg/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM
神经体外培养的生长基质
胶元 多聚赖氨酸 LN
神经细胞培养操作程序表
脊髓后根节 孕18~20天大鼠胚胎
大脑皮质 新生1~3天大鼠
在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜
与CMF-Hanks 液一起移至离心管
神经组织的植块培养法
悬滴培养方法
单盖玻方法
双盖玻方法 1925
改良双盖玻方法
培养物：
CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段
↓
↓
突起
非神经元外伸
优点
所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变
保留了植块内组织特征
不足
培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难
加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为 1×107
种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50μl
放入CO2孵箱中过夜
次日加3ml培养液
2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液
神经元的分离培养过程
大鼠大脑皮层神经组织细胞培养
组织来源
新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。 断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放
天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂
F12
①葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm
②CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更 高
③K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神 经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高 神经元存活，促分化
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
组织块培养→分离细胞培养→ 甚至单一型细胞培养
④非神经元成分的抑制 有 2-3天
神经元无血清限定培养液
人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基 本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同 类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础 培养液中即使能够存活也为期不长，更难以 分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培 养中再添加某些特殊物质。
选择添加剂的基本过程
2. 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变 等，三维重建
2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），神经营养因子
3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。 4. 各种生理病理状态下神经元状态改变
实验方法
研究手段及测量指标
1. 形态学观察： 光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。
短1-2W 长 4个月
体外分化标志
破伤风毒素 NSE NF200,NF160
神经细胞的特殊染色鉴定方法
尼氏体染色 焦油紫 甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色
镀银染色 NADPH-d特异性神经组织化学法
神经细胞培养的应用
应用领域
研究各种因素对神经的影响
1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子， 自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。
神经细胞体外培养 方法及应用
神经细胞体外培养的历史
神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首 创的。
由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、 便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优 点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。
九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养 （ explant culture） 发 展 到 分 离 细 胞 培 养 (dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技 术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。
大鼠海马神经细胞培养方法
神经元体外生长特征
接种密度与体外存活率 当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个
/cm2几乎无神经元存活 当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存
活率最大。
3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子 前3天加药最好神Fra bibliotek元的体外存活时间
以观察单个神经元生长。
神经元的分离细胞培养方法
1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，
成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。
部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大
神经元的体外培养液