微生食物中维生素B12的测定方法
食品中维生素B12的检测方法分析
食品中维生素B12的检测方法分析作者：何嘉明来源：《现代食品·下》2019年第05期摘要：功能性食品、婴幼儿配方乳粉等食品中添加的维生素B12，一般采用微生物比浊法或者高效液相色谱法检测，检测难度较大。
本文归纳了国家标准和AOAC的检测方法，探讨GB 5413.14-2010检测的注意事项，关注试剂盒与国家标准法的效果对比。
关键词：维生素B12;检测方法;试剂盒;国家标准中图分类号：11155.51维生素B12的性状、功能和摄入推荐量维生素B12又名钴胺素，是一类含钴的咕啉类化合物的总称，维生素B12分子中的钴能和-CN、-OH、-CH3或5-脱氧腺苷等基团相连，形成羟基钴胺素（Hydroxycobalamin）、氰基钴胺素（Cyanocobalamin）、脱氧腺苷钴胺素（Deoxyadeno sylcobalamin）和甲基钴胺素（Methylcobalamin）。
其中甲基钴胺参与体内甲基移换反应和叶酸代谢，是N5-甲基四氢叶酶甲基移换酶的辅酶。
5-脱氧腺苷钴胺是甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，参与体内丙酸的代谢。
维生素B12缺乏可引起贫血、高同型半胱氨酸血症、神经精神疾病、生育与出生缺陷等。
在新生儿期，维生素B12：缺乏可严重损害神经系统的发育和功能，婴儿多表现为生长迟缓和神经系统的缺陷。
婴儿一旦发生维生素B12缺乏，维生素B12的低水平将会至少持续1年。
维生素B12缺乏的常见原因可有：①摄入不足。
②获得性吸收不良，如胰源性、胃源性、肝源性或肠源性疾病等。
③对维生素B12需求量增加，如妊娠、产后、绦虫病等。
④先天性维生素B12代谢步骤的障碍。
⑤药源性缺乏。
《中国居民膳食营养素参考摄入量》中推荐的维生素B12摄入量：14岁以上人群为2.4ug·d-1，1-14岁人群需控制在1.0-24ug·d-1，并随年龄增长;1岁以下为适宜摄入量，半岁前为0.3ug·d-1，半岁后为0.6ug·d-1。
维生素b12测定
2 方法与结果2.1 测定波长的选择维生素B12吸收光谱上有三个吸收峰：278 nm、361 nm、550 nm。
维生素B12在361 nm的吸收峰干扰因素少，吸收又最强，中国药典规定以361 nm处吸收峰的比吸光系数E1%1 cm值（207）为计算含量依据［2］。
本实验选择361 nm为测定波长，以标准曲线法为计算含量依据。
2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备［3］：精密称定对照品维生素B12 0.0025 g，置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
将溶解后的溶液放置冰箱中冷藏备用。
2.2.2 供试品溶液的制备：维生素B12片剂为糖衣片，取本品50片，除去糖衣，使其呈现粉红色，研细，精密称定研磨样品，约相当于维生素B12 1.25 mg(每片的标示量为25.0 μg),置50 mL容量瓶中，加水35 mL，充分振摇30 min使其溶解，加水稀释至刻度，密塞，再用力振摇10 min，静置，取上清液，用0.8 μm的微孔滤膜滤过，滤液放置冰箱中冷藏备用。
2.3 线性关系标准曲线的绘制：精取2.2.1项下的储备液，用水分别按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀释，摇匀。
在361 nm波长处测定吸光度，结果见表1。
表1 100 μg/mL标准品稀释倍数测定结果（略）以吸光度A与质量浓度c绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结果表明维生素B12对照品溶液在5.00 μg/mL～100.00 μg/mL范围内质量浓度与吸收程度呈良好的线性关系。
见图1。
2.4 精密度试验精取浓度为100 μg/mL的对照品溶液在361 nm连续测定5次，测得维生素B12的平均吸光度为2.087，RSD为0.7%（n=5）。
RSD数值较小，说明该方法精密度好。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，在冰箱中冷藏2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按2.7项下含量测定法测定，结果见表2，计算得平均吸光度为0.468，RSD为0.99%（n=5）。
食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定(三)
食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定（三）6.4 待测液的制作按表2挨次加水、样品溶液（6.2.2）和测定用培养基（4.3.3）于培养管内，一式三份。
表2待测液的制作 6.5 灭菌将6.3和6.4中全部的试管盖上试管帽，121℃灭菌5min（商品培养基按标签解释举行灭菌）。
6.6 接种将上述试管快速冷却至30℃以下。
用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴（约50uL）测试菌液（6.1.2）（其中标准曲线管中空白S1除外）。
6.7 培养将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养19h～20h。
6.8 测定培养结束后，对每支试管举行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，假如浮现浑浊，则测定无效。
6.8.1 以接种空白管做对比，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2h后重新测定。
两次结果透光率差值若小于2%,则取出所有检验管测其透光率。
6.8.2 用未接种空白试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100% （或吸光度为0）,读出接种空白试管（S2）的读数。
再以接种空白试管（S2）为空白，调整透光率为100%（或吸光度为0）, 依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。
6.8.3 用涡旋混合器（5.4）充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立刻将培养液移入比色皿内举行测定，波长为550nm,待读数稳定30s 后，读出透光率，每支试管稳定时光要相同。
以维生素B12标准品的含量为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。
6.8.4 按照待测液的透光率，从标准曲线中查得该待测液中维生素Bu的浓度，再按照稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。
透光率超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。
6.8.5 对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液维生素B12的浓度，并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%,超过者要舍去。
微生物法测定复方维生素中B12
万方数据
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微生物法测定复方维生素中 (#$
颜 澄 宋 燕
（苏州立达制药有限公司质量部， 苏州， $#)’’*） 方法简便， 无 笔者采用的微生物法分析测定维生素 (#$ ， 需消化、 提纯后处理， 与文献法比较结果相近， 比较可靠。 # 仪器与测试条件 +, 公司制造的 (-. $’’’ 紫外可见分光光度计， #$ 对照 ( 及 培 养 基 的 选 择 菌 种 用 胚 芽 乳 酸 杆 菌 /011 （ $ 样品测定 取样品批号： 研细， 精密称取片粉 # : &)7 左 EI2& $’ 片， 右稀释使其浓度与标准品溶液浓度水平相当。将不同剂量 的 (#$ 标准品溶液及样品溶液分别加入到已滴加 /011 2*!’ 菌种的 (#$ 基础培养基溶液中 。培养后将样品的透光度代入 标准液所得方程， A B 2# : ’ C B )$ : )2$! 计算出供试样品 @ 再乘以其稀释系数得出样品中 (#$ 含 溶液中所含 (#$ 的含量， 量。结果如下： 批号 EI2& 为 EE : *8 ， 批号 EI2) 为 EE : %8 ， 批 号 EI2% 为 #’# : )8 用本法测定 (#$ ， 其操作简单， 可基本满足制剂质量控制 的要求。
维生素B12测定标准操作规程
维生素B12测定标准操作规程1范围本标准规定了用微生物法测定维生素B12的方法。
本标准方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B12的测定。
2方法原理莱士曼氏乳酸杆菌对维生素B12的存在具有极高灵敏性。
利用这种特异性可定量测出样品中维生素B12的含量。
3试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
3.1 维生素B12标准品。
3.2 乙醇：体积分数为25%。
3.3 无菌生理盐水：9g/L。
3.4无水磷酸氢二钠。
3.5无水偏重亚硫酸钠。
3.6柠檬酸（含一个结晶水）。
3.7 氢氧化钠溶液：c（NAOH）为1mol/L。
3.8 HCL溶液：c（HCL）为1mol/L。
3.9 维生素B12提取液：称取1.3g无水磷酸氢二钠（3.4）、1.0g无水偏重亚硫酸钠（3.5）、1.2g柠檬酸（3.6），用100ml蒸馏水溶解。
3.10 菌种：莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）。
3.11 培养基：3.11.1 莱士曼氏乳酸杆菌琼脂培养基。
3.11.2 莱士曼氏乳酸杆菌肉汤培养基。
3.11.3 维生素B12测定用培养基。
4 仪器4.1高压杀菌锅。
4.2 PH剂。
4.3 721分光光度计。
4.4 高速离心机。
4.5 培养箱。
5 制备5.1标准溶液的制备：5.1.1贮备液：称10mg维生素B12标准品（从干燥器中）定容到1000ml乙醇（3.2）中，得到10ug/ml贮备液。
5.1.2中间液.：吸5ml贮备液定容到500ml乙醇（3.2）中，得到100ng/ml中间液，再吸5ml 此中间液定容到500ml乙醇（3.2）中，得到1ng/ml中间液。
5.1.3 标准工作液：分别吸5ml中间液定容到500ml和250ml蒸馏水中，得0.01ng/ml和0.02ng/ml标准工作液。
5.2 菌种的制备：5.2.1 活化菌种：冻干菌种（3.10）(36±1℃18-24h)(36±1℃18-24h)莱士曼氏乳酸杆菌肉汤培养基（10次左右）莱士曼氏乳酸杆菌琼脂培养基（1周转接1次）做样前接复活好的莱士曼氏乳酸杆菌于莱士曼氏乳酸杆菌肉汤培养基中，36±1℃培养18-24h。
微生物法测定发酵食品中维生素B12含量的研究
维生素B12的含量进行了测定。结果表明，在3种腐乳中，臭腐乳维生素B12含量最高，达到（3.57依1.08）滋g/100 g，红腐乳和白腐乳分别为 （0.48依0.21）滋g/100 g和（0.41依0.16）滋g/100 g；除腐乳外，纳豆（0.50 滋g/100 g、0.20 滋g/100 g）、韩国大酱（0.97 滋g/100 g、0.10 滋g/100 g）、
患者周围神经损害程度呈负相关性[5]。 朴相哲等[6]对韩国某地区百岁老人长寿原因进行分析
发现，血清中稳定的维生素B12含量是长寿的一个重要因素。 通过对当地老人饮食的调查发现，韩国传统发酵产品及泡 菜和某些种类的海藻中发现大量维生素B12，这些食物的摄 入对以蔬菜为主的营养不均衡的膳食结构起到互补作用， 从而提高韩国人寿命。
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.06.034
引文格式：曲勤凤，徐琼，张娜娜，等. 微生物法测定发酵食品中维生素B12含量的研究[J]. 中国酿造，2019，38（6）：181-184.
QU Qinfeng1, XU Qiong1, ZHANG Nana1, LIU Yang1*, DOU Tonghai2, ZHONG Jiang2
天然维生素B12存在于动物产品中，包括鱼、肉、鸡蛋和 牛奶等，一般由微生物代谢合成，植物和高等动物无法合 成维生素B12[2]。2016年对上海地区素食人群膳食营养摄入 调查发现，素食者维生素B12的每日摄入量远低于中国居民 膳食维生素B12适宜摄入量[3]。许多学者开始关注到缺乏维 生素B12对人体的影响，研究表明，维生素B12对糖尿病视网 膜神经细胞有一定的保护作用；母亲的维生素B12缺乏或者 摄入不足，可能会因为乳汁中维生素B12含量低导致婴儿的 维生素B12缺乏[4]，人体血清中维生素B12浓度还与帕金森病
维生素B12质量标准及检验规程
目的：明确维生素B12的质量标准和规范维生素B12的检验。
适用范围：维生素B12的检验。
责任人：化验员。
引用标准：CP2000版二部。
本品按干燥品计算，含维生素B12不得少于96.0%.【性状】本品为深红色结晶或结晶性粉末；无臭，无味；引湿性强。
【鉴别】（1）取本品约1mg，加硫酸氢钾约50mg，置坩埚中，灼烧至熔融，放冷，加水3ml，煮沸使溶解，加酚酞指示液1滴，滴加氢氧化钠试液至显淡红色后，加醋酸钠0.5g、稀醋酸0.5ml与0.2% 1-亚硝基-2-萘酚-3,6-二磺酸钠溶液0.5ml，即显红色或橙红色；加盐酸0.5ml，煮沸1分钟，颜色不消失。
（2）取含量测定项上的溶液，照分光光度法（见分光光度法）测定，在278nm、361nm与550nm的波长外有最大吸收。
361nm波长处的吸收度与278nm波长处的吸收度的比值应为 1.70~1.88。
361nm波长处的吸收度与550nm波长处的吸收度的比值就为3.15~3.45。
【检查】溶液的澄清度取本品20mg，加水10ml溶解后，溶液应澄清。
有关物质照高效液相色谱法（见高效液相色谱法）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（17：83）用磷酸调节pH值至3.0为流动相；检测波长为237nm。
理论板数按维生素B12峰计算应不低于2000。
测定法取本品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释成每1ml中含1.0mg的溶液作为供试品溶液；量取供试品溶液适量，用流动相稀释成每1ml中含10μg的溶液，作为对照溶液。
取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的20%，再取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍。
假维生素B12 取本品1.0mg，置分液漏斗中，加水20ml使溶解，加甲酚-四氯化碳（1：1）5ml ，充分振摇1分钟；分取下层溶液，置另一分液漏斗中，加硫酸溶液（1→7）5ml ，充分振摇，上层溶液应无色；如显色，与同体积的对照液﹝取高锰酸钾滴定液（0.02mol/L ）0.15ml ，加水至250ml 比较，不得更深。
微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究
微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究吴环;刘冬虹;张慧;聂炎炎;黄宇峰【摘要】本文建立了微生物法测定食品中维生素B12（VB12）含量的快速方法，通过低温保藏测试菌液、缩小试验体积，以达到缩短检测周期、简化操作步骤，提高结果准确性与重现性的效果。
同时，本文对如何保证试验的有效性和结果的准确性进行了探讨，总结了相关技术要点，为VB12测定微生物法在常规实验室的建立和应用推广提供了参考。
%The article developed a rapid microbiological method for determination of Vitamin B12 in food by storing Lactobacilus leichmannii inoculum at -80 ℃ and minimizing the test volume, which greatly shortened the time and was easy to operate. The article discussed the validity and practicability of the method, summarized the experimental technology to improve the veracity of test results, making routine use of the microbiological assay feasible.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】3页(P42-44)【关键词】维生素B12;微生物法;快速方法【作者】吴环;刘冬虹;张慧;聂炎炎;黄宇峰【作者单位】广东省广州市质量监督检测研究院;广东省广州市质量监督检测研究院;广东省广州市质量监督检测研究院;广东省广州市质量监督检测研究院;广东省广州市质量监督检测研究院【正文语种】中文维生素是维持人体生长发育及新陈代谢而必须从食物中获得的微量有机物质之一。
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微生食物中维生素B12的测定方法微生物测定法1.原理维生素B12对于Lactobacillus leichmannii （ATCC 7830）的正常生长是必需的，在一定生长条件下，Lactobacillus leichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。
本方法最低检出限0.001ng。
2.适用范围本方法参考"Official Methods of Analysis of the Association of official Analytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of the Microbiological Analysis of Selected Nutrients"。
本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。
3.试剂本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1 甲苯3.2 柠檬酸（C6H8O7·3H2O）3.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.4 焦亚硫酸钠（Na2S2O5）3.5 抗坏血酸（生化试剂）3.6 无水葡萄糖3.7 无水乙酸钠3.8 L-胱氨酸（生化试剂）3.9 D,L-色氨酸（生化试剂）3.10 10mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4）乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。
3.12 酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200 ml 3 mol/L盐酸，121℃高压水解6小时。
将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。
加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。
以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。
加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。
滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。
（该试剂也可从Difco 公司购得，产品号为No.0288-15-6。
）? 酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素，确保基本培养基中不含待测定的维生素B12，但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉（Sigma公司），这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含维生素B12。
3.13 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。
加少许甲苯于冰箱中保存。
3.14 维生素溶液Ⅰ：称取25mg核黄素，25mg盐酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15 维生素溶液Ⅱ：将50mg对氨基苯甲酸，25mg泛酸钙，100mg盐酸吡哆醇，100mg盐酸吡哆醛，20mg盐酸吡哆胺，5mg叶酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 甲盐溶液：称取25g KH2PO4、25g K2HPO4溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。
3.17 乙盐溶液：称取10g MgSO4 7H2O、0.5g NaCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO4 7H2O 溶于水并定容至500ml，加5滴浓盐酸。
3.18 黄嘌呤溶液：称取1.0g黄嘌呤溶于200ml水中，70℃加热条件下，加入30ml NH4OH （2+3） L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。
3.19 吐温80溶液：将25g吐温-80溶于乙醇并定容至250ml。
3.20 维生素B12标准溶液（均使用棕色试剂瓶）（1） 3.20.1维生素B12标准储备溶液（100ng / ml）：称取50μg（精度0.01mg天平）维生素 B12暗红色针状结晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至500ml，储存在2～4℃条件下。
（2） 3.20.2维生素B12标准中间液（1ng / ml）：取1ml储备液用（1+4）的乙醇定容至100ml.贮存于2～4℃条件下。
（3） 3.20.3 维生素B12标准使用液（0.02 ng / ml）：取1ml中间液用水定容至50ml，用时现配。
? 维生素B12见光易分解，因此在配制标准液时要尽量避光，并且一定要使用棕色试剂瓶。
3.21 基本培养基：将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH为6.0～6.1，用水稀释至250ml。
酸解酪蛋白 25ml腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml天冬胺酰溶液 5ml吐温-80溶液 5ml甲盐溶液 5ml乙盐溶液 5ml维生素溶液Ⅰ 5ml维生素溶液Ⅱ 5ml黄嘌呤溶液 5ml抗坏血酸 1.0gL-胱氨酸 0.1gD,L-色氨酸 0.1g无水葡萄糖 10.0g无水乙酸钠 8.3g该培养基也可从Difco公司购得，产品号为No. 0457-15-1。
? 由于国内某些试剂纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，严重影响到最后的浊度测定结果，因此建议最好使用进口培养基。
3.22 琼脂培养基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖，2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml吐温-80溶液，每500ml液体培养基加5.0~7.5g琼脂，加热溶解，用10mol/L氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000ml，分装于试管中，于121℃高压灭菌10分钟，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存。
3.23 生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中，。
每次使用时分别倒入2～4支试管中，每支约加10ml，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，备用。
3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示剂：称取0.1g溴甲酚紫于小研钵内，加1.6ml 0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
4.仪器与设备4.1 实验室常用设备4.2 电热恒温培养箱4.3 压力蒸汽消毒器4.4 液体快速混合器4.5 离心机4.6 硬质玻璃试管：20mm×150mm5.菌种与培养液的制备与保存5.1 储备菌种的制备：Lactobacillus leichmannii （ATCC 7830）接种于直面琼脂培养管中，在37±0.5℃恒温箱中培养16~24小时，取出后放入冰箱中保存。
每周至少传种二次以上。
在实验前一天必须传种一次。
? Lactobacillus leichmannii （ATCC 7830）的生命力不强，每周一定要至少传代2-3次，否则极易死亡!5.2 种子培养液的制备：加2ml 0.02ng/ml维生素B12标准工作液和3ml基本培养基于10ml 离心管中，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却后于冰箱中保存。
每次制备两管，备用。
? 加入离心管中的维生素B12标准工作液要适量，过少会阻碍Lactobacillus Leichmanni的生长，过多会使零管中的光密度值增大，影响测定结果的准确性。
一般2-3ml即可。
6. 操作步骤6.1 接种液的配制：使用前一天，将已在琼脂管中生长16~24小时的L. leichmannii 接种于种子培养液中，在37±0.5℃培养16~24小时，取出后离心10分钟（3000rpm），弃去上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3ml灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，立即使用。
6.2 水解液的制备：称取1.3g无水磷酸二氢钠、1.2g柠檬酸及0.1g焦亚硫酸钠（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用时现配。
6.3 称取适量样品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混匀，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却至室温，过滤，然后以溴甲酚紫为外指示剂，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.0~6.1，将水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。
为保证最后样品测定管中的Na2S2O5的浓度≤0.03mg/ml，因此要做适当的稀释。
? 测定管中Na2S2O5的浓度一定要小于0.03mg/ml，过多会抑制L. Leichmannii的生长，因此在称取样品时要考虑到后来的稀释倍数，避免由于稀释倍数过大造成测定管中的维生素B12含量过低，无法检出。
? 实验所用的所有试管必须在烤箱中180-200℃条件下干热灭菌2-3小时。
6.4 样品试管的制备：每组平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 ml样品水解液，并用水稀释至5ml，然后再加入5ml基本液体培养基。
6.5 标准系列管的制备：每组试管中分别加入维生素B12标准工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，使每组试管中维生素B12的含量为0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng，加水至5ml，再加入5 ml基本液体培养基，需做三组标准曲线。
6.6 灭菌：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121℃高压灭菌10分钟。
? 灭菌时间不宜过长，否则会破坏基本培养基中的营养成分，影响Lactobacillus Leichmannii 的生长，最好在5-10分钟内。
6.7 接种与培养：待试管冷至室温后，每管接一滴种子菌液，于37±0.5℃恒温箱中培养16~20小时。
? （1）接种前，接种室要在紫外灯下消毒至少30分钟。
（2）在接种时，其中一支标准系列0管可不接种，这样可观察此次实验是否存在污染，并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差。
6.8 测定光密度值：于640nm波长条件下，以标准系列中零管调节仪器零点，测定样品管液体及标准管液体的光密度值。
? 首先以未接种的标准系列0管进行仪器调零，然后在用接种后的标准系列0管进行二次调零，之后再测定其他管中液体的光密度值。
7.结果计算以维生素B12标准系列的不同纳克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
由样品测定管中的光密度值在曲线上查出相对应的样品测定管中的维生素B12含量，再按以下公式计算样品中维生素B12含量：c·V·fX= --------------×100m×1000式中：X──样品中维生素B12含量，μg/100g：c──测定管中的维生素B12含量，ng：V──样品水解液的定容体积，ml：f──样品液的稀释倍数m──样品质量，g。