蛋白质相互作用多种方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
研究蛋白质相互作用的方法
研究蛋白质相互作用的方法
1. 酵母双杂交呀，这就像是给蛋白质牵红线，看它们能不能对上眼！比如说，我们研究那两个蛋白质，就把它们分别放到酵母里，看它们能不能相互吸引，哇，真的很神奇呢！
2. 免疫共沉淀那也是超厉害的哦！就像是从大部队里精准地捞出我们想要的那两个蛋白质小伙伴。
就像研究细胞里的那两个关键蛋白，通过这个方法把它们一块儿抓出来，看看它们的关系，你说有趣不有趣呀！
3. 亲和层析呀，不就是设个专门的陷阱让目标蛋白质掉进去嘛！举个例子，我们要找那个特定的蛋白质，就设计个跟它特别契合的柱子，让它乖乖进去，然后就能研究它啦，是不是超棒呀！
4. 荧光共振能量转移，哇塞，这简直就是在蛋白质之间观察神秘的能量传递呀！比如说观察那两个发着光的蛋白质，看它们之间能量怎么流动，那感觉真的太奇妙啦！
5. 表面等离子体共振呢，就像是给蛋白质的互动建了一个超级敏感的检测站呀！比如研究那两个蛋白结合的过程，细微的变化都能察觉到，牛不牛啊！
6. 噬菌体展示技术也很有意思呢，就像是让蛋白质在噬菌体这个舞台上展示自己。
比如我们想找和某个分子结合的蛋白质，通过噬菌体就能把它们找出来，多神奇呀！
7. 蛋白质微阵列，这不就是把一堆蛋白质摆出来让人一目了然嘛！像我们把各种蛋白质放在那上面，然后就能快速了解它们之间的关系啦，酷不酷！
8. 生物膜干涉技术呀，就像是在蛋白质的世界里放了一个精准的测量仪。
例如我们想知道那两个蛋白质结合的实时情况，用这个技术就能清楚看到，你说厉害不厉害！
我觉得这些方法各有各的独特之处，都为我们深入研究蛋白质相互作用提供了强大的工具，让我们能更好地理解蛋白质的奥秘！。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较蛋白质相互作用是生物学研究中的重要课题，对于理解细胞生物过程以及疾病的发病机制具有重要意义。
目前已经开发出多种实验方法用于检测蛋白质相互作用，其中最常用的方法包括：免疫共沉淀、双杂交、表面等离子共振、斑点免疫印迹、荧光共振能量转移（FRET）和生物传感等。
下面将对这些方法进行比较。
免疫共沉淀是一种利用抗体特异性识别蛋白质相互作用的方法。
通过特异性抗体与检测蛋白质结合，将目标蛋白质及其相互作用的蛋白质一起通过沉淀进行分离和检测。
这种方法常用于检测蛋白质复合物，缺点是需要高质量的抗体，抗体的选择和结合效率对结果的可靠性有较大的影响。
双杂交是一种检测蛋白质相互作用的基因工程方法。
该方法利用两个蛋白质的相互作用引起的转录活性调控来筛选蛋白质相互作用。
该方法的优点在于操作简单，筛选速度较快，但是可能存在假阳性结果以及对蛋白质的折叠状态和后转录修改对结果的影响。
表面等离子共振是一种通过测量光敏感表面上的变化来检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过共振的光波与蛋白质结合引起的表面层折射率变化来测量蛋白质的结合动力学参数。
该方法的优点在于实时、直接、无标记以及高灵敏度。
斑点免疫印迹是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过将蛋白质分离电泳然后向膜转移，并使用特异性抗体来探测蛋白质的相互作用。
该方法的优点包括操作简单，对蛋白质的结构没有要求，但是这种方法不能提供定量信息。
荧光共振能量转移（FRET）是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过基于荧光分子之间的非辐射能量转移来测量蛋白质的相互作用。
该方法对于分子间距离和颗粒之间的角度较敏感。
FRET要求有适当的选择标记的蛋白质，并能够量化蛋白质的相互作用。
生物传感是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过表面增强拉曼散射（SERS）或增强荧光技术来获得蛋白质的信号。
该方法对于小样本和灵敏度要求较高的蛋白质相互作用研究具有优势，但需要专门的实验条件和设备。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
蛋白质相互作用研究方法
蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间的相互作用和相互调节。
研究蛋白质相互作用的方法有很多种，下面将介绍其中一些常用的方法。
1. 酵母双杂交检测（Y2H）：该方法是通过基因转录和细胞生理过程来检测蛋白质相互作用。
该方法的基本原理是将感兴趣的两个蛋白质分别连接到酵母细胞中的转录因子的DNA结合结构域和激活结构域，当这两个蛋白质发生相互作用时，转录因子被激活，从而触发报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平来确定蛋白质之间的相互作用程度。
2. 免疫共沉淀：该方法是利用两个蛋白质之间的特异性相互作用来检测和分离它们。
首先，在一个蛋白质中引入一个标签，比如His标签。
然后，将该蛋白质在体外与另外一个感兴趣的蛋白质一起孵育，使它们发生相互作用。
最后，利用特定的抗体识别标签，并用亲和树脂或磁珠来沉淀包含这些标签的复合物。
通过酶解、电泳等方法对复合物进行分析，可以确定两个蛋白质之间的相互作用。
3. 光学方法：如可以利用荧光共振能量转移（FRET）技术来研究蛋白质相互作用。
该技术基于两个发射荧光染料的距离变化会改变吸光度的原理，当两个蛋白质相互作用时，可以通过激发一个染料并检测另一个染料发射的荧光信号来确定它们之间的相互作用程度。
4. 质谱法：质谱法是一种广泛应用的蛋白质相互作用研究方法。
其中，串联质谱法（MS/MS）可以用来鉴定蛋白质复合物中的组分。
根据质谱分析的结果，可以确定两个蛋白质之间的相互作用和结合部位等信息。
此外，还有其他一些方法如共结晶、核磁共振、冷冻电镜等，可以对蛋白质相互作用进行研究。
这些方法的选择取决于研究者所关注的蛋白质特性、相互作用类型以及研究目的等因素。
需要注意的是，以上方法在研究蛋白质相互作用时有其局限性。
比如，一些方法需要在体外进行，无法反映细胞内环境；一些方法可能对于某些蛋白质的研究不适用；一些方法可能存在假阳性和假阴性等问题。
因此，在选择研究方法时，需要综合考虑各种因素，并采取多重方法相互印证，以获得准确可靠的结果。
蛋白质互作的原理
蛋白质互作的原理
蛋白质互作是指两个或多个蛋白质相互结合并发生相互作用的过程。
蛋白质的互作可以通过多种方式实现，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA或RNA 相互作用等。
蛋白质互作的原理主要涉及到以下几个方面：
1. 相互作用位点的互补性：蛋白质的结构和功能决定了其相互作用位点的互补性。
相互作用位点的互补性意味着两个蛋白质的结构和功能能够相互匹配，从而实现相互结合和作用。
2. 疏水作用：蛋白质互作中，疏水作用在蛋白质之间的结合中起到重要的作用。
疏水作用是指非极性氨基酸残基在水中聚集形成疏水核心，从而促使蛋白质分子互相接近并结合。
3. 氢键和离子键：蛋白质互作中，氢键和离子键也扮演重要角色。
氢键和离子键的形成可以增强蛋白质之间的相互作用力，从而促使它们结合并发生相互作用。
4. 构象变化：蛋白质互作过程中，通常会伴随着构象的变化。
蛋白质的构象变化可以使得相互作用位点更好地匹配，进而增强相互作用的强度和特异性。
总体来说，蛋白质互作的原理涉及到相互作用位点的互补性、疏水作用、氢键和
离子键的形成以及构象的变化等多个因素。
这些因素共同作用，使得蛋白质可以相互结合并发生相互作用，从而实现一系列生物学过程的调节和执行。
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优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； 3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白 复合物。
缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的 蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不 正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性， 灵敏度不如亲和色谱高。
• 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、 等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域 (DNA-binding domain)和转录激活结构域 (transcription-activating domain)。 • 前者可识别DNA上的特异17bp长序列 （UAS），并使转录激活结构域定位于所调节 的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合 体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转 录。
主要用于： 两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用； 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。
注意： 1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不 变。因为出现假阳性的概率比较高。 2 设置的对照：在对照组中使用对照抗体，以 缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。
Western blot
1、电转移效率 2、PVDF膜的充分浸润 3、转移液中有太多的SDS 4、膜的损坏 5、转移时胶和膜没有完全接触 6、抗体的问题 7、抗体的浓度太高或太低 8、还原性物质的存在 9、封闭不充分
蛋白质相互作用研究方法
生物物理学方法 分子生物学方法 遗传学方法
Pull down 试 验
免 疫 共 沉 淀
串 联 亲 和 纯 化
噬 菌 体 展 示 技 术
酵 母 双 杂 交 技 术
基 因 外 抑 制 子
合 成 致 死 筛 选
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation，CO-IP）
一、酵母双杂交系统基本原理
1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用 了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域,DNA结合域 (DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因或含有靶基 因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上,将这两种质粒 共同转化酵母感受态细胞,若BD间结合时,则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近,呈 现GAL4转录因子的完全活性,启动下游的报告基因如His及 LacZ等基因的表达,从而在特定的缺陷培养基上生长。
生物学效应
稳定相互作用 形成蛋白质复合体
瞬时相互作用
（enzyme-substrate） （protein complex）
稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋 白质相互作用的内涵。
研究蛋白质相互作用是为了研究相应的 生物学功能
确定研究目标
寻找相互作用
建立相互作用网络 和功能体系
• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直 接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些 作用的生物学意义。 容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知 道这些相互作用有什么生物学意义。 • 从生物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物 学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步 研究相关蛋白质的相互作用。 容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。
亲和纯化（ affinity purification ）
• 纯化： 抗体 Epitope-tag：flag, myc, HA, V5, GST… 核酸 • Pull-down • Immunoprecipitation • TAP (Tandem Affinity Purification)
酵母双杂交（Yeast two-hybrid ）
靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载 体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X） 把GST融合蛋白(探针、诱饵蛋白)挂到带有GST 底物的Sepharose beads上，然后把另一种含目 的蛋白质（捕获蛋白）的溶液加入其中。由于谷 胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发 生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集 下来，洗脱非特异结合的蛋白后采用SDS-PAGE 鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。
Mammalian Tap-tag-LC-MS/MS method
TAP优点
加工和修饰过的蛋白可以作诱饵，相互作用发生在天然环 境和细胞部位，一次操作可以分离和分析多组分的复合物， 得到广泛应用， 由于TAP标签的高度特异性以及采用两步洗脱纯化法，在 纯化过程中不需要强烈冲洗，因此可以更好地保持较不稳 定的蛋白质复合物，而且非特异蛋白的量也会很低，这是 一步纯化法所不能比拟的。 克服了双杂交筛选步骤复杂、假阳性结果较多、难于量化、 不能满足大规模蛋白质组研究需要的缺陷。
人类蛋白质组相用
蛋白质相互作用： 1. 本身具有生物学意义：这样的相互作 用在生物体中是起什么作用 2. 发展技术：利用这样的相互作用创造 出一些人为的作用
运用生物信息 学的方法由繁 入简
实验分析 的方法由 简入繁
整体
系统
部分 单体
酵母蛋白质相互作用联络图 人蛋白质相互作用联络图
研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相 互作用的生物学意义
GST pull down
GST fusion protein 不够纯， 用作bait会产生太多的非特 异性蛋白质污染。
检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用：
1、放射性标记融合蛋白：快速简单易行 2、抗GST抗体检测 3、生物素标记融合蛋白：没有放射性，但可能对探 针蛋白和其他蛋白的相互作用有影响。
实验流程
1、基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因 置换为带有TAP标签的基因，温和裂解细 胞，获取细胞抽提物。 2、将抽提物加入IgG亲和柱，TAP标签的 ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液 洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白。
3、含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割 下来。在钙离子参与下，被切割下来带有CBP的 蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充分洗脱， 就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质，最 后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。 4、经过串联亲和纯化的目的蛋白，通过SDSPAGE或者双向电泳分离之后，找出与目的蛋白 相互作用的蛋白质，采用质谱分析的方法对其进 行分析鉴定。
பைடு நூலகம் TAP缺点
更倾向于高丰度和稳定的相互作用，许多低亲和力、瞬 时和依赖特殊细胞环境的相互作用可能检测不到。 另外，TAP必须采用能产生表达TAP标签的蛋白，这种 标签蛋白的表达最好接近生理水平，所以最好将带标签 的基因用天然启动子表达。但在哺乳动物细胞中，天然 启动子表达标签蛋白是非常困难的，其表达水平不同于 无标签的内源蛋白，由非生理水平的诱饵蛋白而产生假 阳性。
串联亲和纯化（ TAP）
近年来质谱技术发展迅速，其功能强大且灵敏 度高，常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合 体亚基 ，但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复 合体，成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。 1999年Rigaut （德国）等人共同提出了一套分离 复合蛋白的新方法—串联亲和纯化(Tandem affinity purification，TAP)，兼具标准亲和纯化 （可以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体）和免 疫共沉淀（用于特异性的标记蛋白与亲和柱之间的 相互作用）两种生化方法的优点，为蛋白质复合体 的分离鉴定提供了一条新路径。
GST pull-down技术
1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一 步纯化出GST融合蛋白,从此GST融合蛋白在研究 蛋白质相互作用领域得到极大推广(His也常用)。 此方法是一个行之有效的验证酵母双杂交系统 的体外试验技术。还应当在体内用单独的方法， 如免疫共沉淀加以证实。
原 理
蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规 律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了 遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法
研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合
象与象的一部分
研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动 的基础。
2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是 发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是 发挥其功能的主要活动。
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 A
B
Y
B Y Y A
非特异性
实验过程
实验过程
• （1）加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清； • （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应 的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； • （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次 3,000 rpm离心3 min； • （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜 的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂 糖珠偶连； • （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将 琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲 液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； • （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
适用： 研究蛋白质复合体中多个蛋白质间的相互 作用，特别适用于研究蛋白质在生理条件 下的相互作用
原理方法
首先通过基因工程给 被分离纯化蛋白的一 端加一个TAP标签， 该标签由IgG结合结 构域 (ProtA)及一个 钙调蛋白结合多肽 (CBP)组成，结构域 与多肽之间由一个 TEV蛋白酶切位点隔 开。