蛋白质分离纯化技术
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。
而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（三）根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。
蛋白质分离技术全ppt课件
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
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一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
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Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
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水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
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⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
对蛋白质分离纯化的方法
对蛋白质分离纯化的方法
蛋白质分离纯化的方法有很多种，常用的方法如下：
1. 溶液的分离：利用差速离心、过滤或超滤等方法，将悬浮液或溶液中的蛋白质与其他组分分离开。
2. 色谱层析：将蛋白质溶液经过色谱柱，利用分子大小、电荷、亲疏水性等物理性质作用于柱内填充物，实现蛋白质的分离纯化。
3. 电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质以及大小和形状的差异，在凝胶电泳或毛细管电泳中进行分离纯化。
4. 凝胶过滤：利用凝胶的孔隙结构，根据蛋白质的分子大小将蛋白质分离开。
5. 亲和层析：利用蛋白质与亲和配体之间的特异性相互作用实现分离纯化。
6. 离子交换层析：利用蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作用实现分离纯化。
7. 逆流电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质和溶液中的流动，通过逆流电泳系统实现蛋白质的分离纯化。
8. 蛋白质沉淀：利用加入盐、酸、有机溶剂等物质改变蛋白质的溶解度，使其沉淀下来。
以上是常用的蛋白质分离纯化方法，不同方法适用于不同的蛋白质特性和实验目的。
需要根据具体情况选择合适的方法进行操作。
蛋白质分离纯化设计
蛋白质分离纯化设计1. 简介蛋白质分离纯化是一项重要的实验技术，在生物医药、食品科学、农业等领域有着广泛的应用。
通过对蛋白质进行分离纯化，可以获得单一纯度的蛋白质用于后续研究及应用。
本文将详细介绍蛋白质分离纯化的设计方法和常用技术，包括样品准备、分离方法选择、纯化步骤设计等。
同时，我们还将讨论常见的挑战和解决方案，以及如何评估分离纯化效果。
2. 样品准备在进行蛋白质分离纯化前，首先需要准备好样品。
样品的选择和准备对于后续分离纯化过程非常重要。
2.1 选择合适的样品样品可以来自细胞、组织、体液、培养基等。
在选择样品时，需要考虑到蛋白质的种类、表达水平、目标纯化程度以及后续实验需要。
2.2 样品预处理样品在分离纯化前需要进行预处理，以去除可能干扰纯化过程的杂质。
常用的预处理方法包括细胞破碎、离心、除去非蛋白质成分等。
预处理方法的选择应根据样品类型和后续纯化方法进行优化。
3. 分离方法选择根据蛋白质分离的原理和样品特性，我们可以选择合适的分离方法。
常见的分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤、透析、亲和层析等。
3.1 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质带电性质的分离方法。
可以根据蛋白质的以阴离子或阳离子带电来选择合适的离子交换树脂，实现不同蛋白质的分离纯化。
3.2 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质大小的分离方法。
通过选择适当的孔径大小的凝胶，可以分离不同分子大小的蛋白质。
3.3 透析透析是一种基于蛋白质分子量和溶液成分的分离方法。
通过选择适当的膜材料和透析缓冲溶液，可以实现蛋白质与小分子化合物的分离。
3.4 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合来分离纯化的方法。
选择合适的亲和配体，可以选择性地结合目标蛋白质，从而实现其分离纯化。
4. 纯化步骤设计在选择合适的分离方法后，需要设计纯化步骤来实现目标蛋白质的分离和纯化。
纯化步骤的设计应根据分离方法的特点和目标蛋白质的性质进行优化。
4.1 样品加载将预处理的样品通过适当的装载方式加载到分离纯化柱中，如使用注射器将样品缓慢注入。
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法蛋白质是生命体中最基本的组分之一，对于深入理解生命科学方面的各个领域是至关重要的。
然而，蛋白质作为生物大分子，其结构和特性十分复杂，因此需要采用一系列的纯化方法，使其从杂质中得以分离出来。
1. 盐析法盐析法是通过不同浓度的盐水进行分离蛋白质。
盐水的浓度会对蛋白质的稳定性、电荷、溶解度以及亲水性产生影响，使得蛋白质从盐水溶液中析出。
通过盐析法可以分离出不同的蛋白质分子量、电荷等性质相差较大的蛋白质。
这种方法可以用于初步分离，然后再用其他方法进一步纯化。
层析法依据蛋白质和基质之间的亲和力、大小、形状、电荷等差异进行分离。
将蛋白质样品通过某种基质包装的柱子进行逐层析出，蛋白质在不同基质上的亲和力使得其被不同基质吸附，最终通过洗脱等后处理方法，将其分离出来。
3. 水解法水解法是将蛋白质样品加入酸性或碱性等反应性溶液中，使蛋白质分子断裂成更小的肽链。
通过不同的水解方法和处理方法，可将蛋白质分离出来。
4. 电泳法电泳法根据蛋白质的电性和分子大小来进行分离。
通过蛋白质在电场中的电荷和电泳时的分子大小来颗粒分裂，将其分离出来。
电泳法包括等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE电泳、双向电泳等方法，其中比较常用的是SDS-PAGE电泳。
5. 亲和层析法亲和层析法利用蛋白质与特定配体之间的强亲和力来进行分离。
通过在某一配体上固定蛋白质，利用比较特异的亲和性从多种蛋白质中选择性地吸附目标蛋白质，最终将目标蛋白质从基质中析出。
透析法是一种通过滤过和受限扩散等原理，通过基质和蛋白质之间的分子量和性质差异来进行分离。
透析法通常用于去除杂质，如去除蛋白质样品中的盐、淀粉等。
综上所述，蛋白质纯化方法的选择取决于蛋白质的性质，结构和形态等因素。
无论采用哪种方法，都需要在实验前根据目标蛋白质的性质进行调研和试验，谨慎选择，才能得到理想的分离效果。
蛋白质的分离、纯化
胰岛素的分离纯化
胰岛素是一种由胰腺分泌的激素， 具有降低血糖的作用。胰岛素的 分离纯化通常采用离子交换色谱
和结晶法。
胰岛素的分离纯化对于治疗糖尿 病具有重要意义。纯化的胰岛素 可以用于注射，帮助糖尿病患者
控制血糖水平。
在胰岛素的分离纯化过程中，需 要特别注意避免蛋白质的聚集和 变性，以确保产品的安全性和有
利用半透膜，根据不同物质之间的分 子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间 的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分 析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键 等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进 行分离，再通过染色或放射自显影等技术 进行检测。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使 蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有 乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中 的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的 分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度 离心技术，将不同密度的蛋白质进行 分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质在水中的溶解度 受pH、离子强度、温度 等因素影响。不同蛋白 质具有不同的溶解度。
蛋白质的分离纯化方法
沉淀法
利用蛋白质的溶解度差异，通过改变 某些条件（如pH、离子强度、温度 等）使蛋白质沉淀析出。
离心分离
利用离心机的高速旋转产生的离心力， 根据不同物质之间的密度和沉降系数 差异进行分离。
膜分离
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质 的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。
蛋白质提取与纯化技术总结
蛋白质提取与纯化技术总结蛋白质提取与纯化技术1.蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
有机溶剂提取法：一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
蛋白质纯化分离方法
蛋白质纯化分离方法
蛋白质纯化分离方法是指通过一系列的技术手段,将混合物中的目标蛋白质分离出来,以便于后续的研究和分析。
蛋白质是生物体内最重要的分子之一,是生命活动的重要驱动力。
在科学研究和工业生产中,蛋白质纯化分离技术具有重要的应用价值。
蛋白质纯化分离的方法有很多种,其中最常用的方法是免疫纯化法和化学纯化法。
免疫纯化法是指利用免疫筛选技术,将目标蛋白质与杂质分离开来。
化学纯化法则是利用化学反应或物理分离技术,将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
除了免疫纯化和化学纯化法,还有其他一些蛋白质纯化分离的方法,如磁选、电泳分离、沉淀法、离心法等。
这些方法各有优缺点,选择何种方法取决于混合物的特点和目标蛋白质的性质。
免疫纯化法和化学纯化法是最常用的蛋白质纯化分离方法。
免疫纯化法的优点在于操作简单、分离效率高、结果可靠,适用于多种蛋白质的纯化。
化学纯化法的优点在于分离精度高、纯化效率高、结果稳定,适用于高含量蛋白质的纯化。
除了这两种方法,还有其他一些蛋白质纯化分离的方法,如磁选、电泳分离、沉淀法、离心法等。
这些方法各有优缺点,选择何种方法取决于混合物的特点和目标蛋白质的性质。
蛋白质纯化分离技术的发展,为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
在蛋白质纯化分离的过程中,需要考虑到混合物的特点、目标蛋白质的性质、纯化方法的选择等因素,以确保蛋白质的纯化质量和结果的可靠性。
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到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各
步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。 在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存
在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
蛋白质纯化的常用方法
采用分离和提纯蛋白质的各种方法，主要是利用蛋白质之间的各 种特性差异：
1.根据分子大小不同的分离方法 2.利用溶解度差别的分离方法 3.根据蛋白质的吸附性质分离 4.根据对配基的生物学特异性 5.根据蛋白质分离
小结
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在， 每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。
目前还没有一套单独、现成的方法能把任何一种蛋白质从复
杂的混合蛋白质中提取出来。 所以对任何一种蛋白质都有可能选择到一套适当的分离纯化
程序以获得高纯度的制品。
THANK YOU！
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来， 再用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓
冲溶液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质
而定。
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质纯化
在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受
一般程序
预处理 蛋白质的抽提
蛋，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞 中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态，不丧失生物活
性。
常用的破碎方法有： 机械方法：如均浆喷射、研磨或超声波
化学法：如去污剂、有机溶剂处理
酶学方法：如溶菌酶处理
蛋白质的抽提
胶的分级范围。
利用溶解度差别的分离方法
等电点沉淀和PH值控制：等电点时蛋白质的净电荷为零，溶解度最低。 相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的 pH值来分离纯化蛋白质。 蛋白质的盐溶和盐析：中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中, 增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。
有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使
蛋白质在水中的溶解度显著降低。而且在一定温度、pH值和离子强度下, 引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分 离纯化蛋白质。
根据蛋白质的吸附性质分离
某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等，具有 吸附能力，能够以不同强弱的吸附力吸附蛋白质。
中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生
特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性 结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。 离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子 交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱 液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。
根据对配体的特异亲和力进行纯化
配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团、分子。 如酶的作用底物、辅酶及其结构类似物。 亲和层析，这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋 白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化 学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起 的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参 与。 蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯 化出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与 功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生 物产业中的核心技术。
根据分子大小不同的分离方法
透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其 他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
离心分离：蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们
分开，经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。 凝胶过滤层析：利用凝胶介质交联度或者孔度（网孔大小）来决定凝