第八章 电镜冷冻制样技术NEWB
生物物理学实验技术的使用教程
生物物理学实验技术的使用教程生物物理学是一门研究生命现象和生命系统的科学，旨在理解生命的本质和原理。
为了探索生命现象并从中获得有价值的信息，研究者常常需要运用各种实验技术。
本文将介绍几种常见的生物物理学实验技术及其使用方法。
一、冷冻电镜技术冷冻电镜技术是一种观察生物样品超高分辨率结构的有效方法。
它通过冷冻快速冻结样品，制作薄冰切片并在电子显微镜下进行观察。
首先，将样品悬浮在稳定的冷冻介质中，如液氮。
然后，使用特殊的冷冻装置迅速冷冻样品到液氮温度并固定。
接下来，使用超薄切片技术将样品制作成薄片，通常在液氮中进行。
最后，将样品载入电子显微镜，使用高分辨率图像记录样品结构。
二、质谱分析技术质谱分析技术是一种测定分子化学组成和结构的方法。
质谱仪通过将样品中的分子转化为离子，并将这些离子按质荷比分离和检测。
首先，将样品引入质谱仪中，常用的引入方式包括气相进样和液相进样。
然后，利用质谱仪中的离子源将样品中的分子离子化，如电离源和高能激光。
接下来，离子经过质量分析器的作用，根据离子质荷比分离，并被记录下来。
最后，通过分析质谱图谱中的离子峰来确定样品的成分和结构。
三、原位荧光显微镜技术原位荧光显微镜技术通过使用荧光标记的分子探针来观察生物样品。
首先，选择合适的荧光分子探针，如荧光染料或荧光蛋白，对感兴趣的分子或结构进行标记。
然后，将样品放置在显微镜台上，并使用适当的激光或光源激发标记分子的荧光。
接下来，通过显微镜观察样品，并使用适当的滤光片或光路来捕捉和记录荧光信号。
最后，通过对荧光图像进行分析和处理来获取关于样品的信息。
四、结构生物学技术结构生物学是研究生物分子三维结构的方法。
其中，X射线晶体学和核磁共振成像（NMR）是两种常用的技术。
在X射线晶体学中，首先获得生物分子的晶体，并使用X射线对晶体进行衍射。
然后，通过收集和分析衍射图像，确定晶体的原子分布和结构。
在NMR中，利用核磁共振技术观察生物分子中的原子核在磁场中产生的共振信号。
冷冻电镜技术
冷冻电镜技术或冷冻电子显微学(Cryo-electron microscopy) (Cryo electron microscopy)梁毅(武汉大学生命科学学院)生物分子的结构分析现代生物学仪器分析中的“四大谱”和“三大法”●传统上最有效的方法是“四大谱”：●紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱和质谱生物大分子（蛋白质和核酸等）结构测定●的最重要和应用最广泛的三大方法：●X 射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析和冷冻电镜什么是电镜？电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器●电镜用于生物样品的结构研究是众所周高分辨率的电镜可以达到0.l 知的，目前0l 乃至水平，这是指在特定条件下nm3Å可分辨的两点的距离。
●虽然这已接近原子分辨水平，但由于种种原因要看到构成生物大分子的碳、氢、氧原子的三维排布仍是很困难的。
●首先，构成生物物质的碳、氢、氧、氮等元素对电子的散射能力较弱；●其次高速电子的轰击会对生物样品造成辐射损伤，后者在生物样品的高分辨率结构分析中是最严重的问题。
●损伤机制包括非弹性散射引起的化学键断裂，也包括电子轰击引起离子、自由基和分子碎片扩散，从而造成生物样品的质量损失。
●因此利用电子显微镜对生物大分子进行研究必须首先把观察对象制备成特殊的样品。
●电镜的样品制备方法有许多种，在有关生物大分子结构研究中，负染、葡萄糖包埋以及冰冻含水（正染）等方法是常用的。
电镜载网●电镜观察的样品需要在特制的金属载网上才能送入电镜镜筒中进行观察。
载网的直径通常为4mm，可以用铜、银、铂、镍等金属或铜镍、银镍合金等制成。
最常用的载网为铜制的，所以电镜载网一般又称作电镜铜网。
铜网网孔的形状多样，有圆形的、方形的、单孔形和狭缝形；网●孔的数目有50目、100目、200目、300目和400目等多种规格。
网孔越大，观察的有效面积越大，但同时对样品的支持稳定性也越差。
冷冻电镜技术
冷冻电子显微镜技术冷冻电子显微镜技术在20世纪70年代时提出，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟，近年来已经进入了快速发展的时期。
它的研究对象非常广泛，包括病毒、蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等。
一方面，冷冻电微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。
因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KD）样品的限制。
另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克了因化服学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像,包括样品制备、图像采集、图像处理及三维重构等几个基本步骤。
一、样品制备用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。
生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。
现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。
冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。
该方法有两个步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。
在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。
其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。
二、图像采集冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。
在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。
由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术。
经过透射电子显微镜中一系列复杂的过程，最终在记录介质上会形成样品放大几千倍至几十万倍的图像。
冷冻电镜
冷冻电镜产生背景
上世纪50年代，利用X射线成像技术解析蛋白质结构，人们 才首次得以拍出蛋白质晶体的螺旋状结构图片。 X射线晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。其中关 键步骤之一即是，为获得可供X射线衍射的单晶，需要将纯 化后的生物样品进行晶体生长。现实情况却是，目前很多 复杂的大分子物质难以获得晶体。
冷冻电镜的发明及其在生物学的应用
报告人：XXX
冷冻电镜是什么？
冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy） 简称
冷冻电镜：应用冷冻固定技术，低
温下使用透射电子显微镜观察样品的 显微技术，从而得到生物大分子的结 构。
我们或许在不久的将来就能获得生命复杂 机制的原子级分辨率的图片了
1981年，弗兰克完成了单颗粒三维重构算 法及软件Spider，利用计算机识别图像把 相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将 轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析 不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的 2D图像。在此基础上，通过数学方法，在 同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系， 以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的 图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基 础。
冷冻电镜的工作原理：
原理： 样品经过在液氮中的冷冻固定， 使得生物大分子中的H2O分子以玻璃态 的形式存在，保持低温，将样品放入显 微镜，高度相干的电子作为光源从上面 照射下来，透过样品和附近的冰层，受 到散射，利用探测器和透镜系统把散射 的信号成像记录下来，再进行信号处理， 最后利用三维重构的技术得到样品的三 维结构。
4.研究生物大分子复合物的结构 如：病毒-受体复合物的结构 5.研究细胞器甚至是活细胞的结构 如:生物分子在运动过程中的结构和结构的变化
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冷冻电镜技术PPT课件
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM
冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cryo-electron microscopy，cryo-EM)，是将生物大分子快速冷 冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样 品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样 品的三维结构。
4
1 冷冻电镜技术的概述
看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的
膜蛋白结构。
13
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜技术 Cryo-EM
1
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类
目
C
O录
N T E N T S
2 冷冻电镜技术的发展
1968—→Now
3 冷冻电镜技术的原理
样品冷冻、冷冻成像、三维重构
4 冷冻电镜技术的应用
结构生物学、医疗、具体应用场景
2
1
PA R T
冷冻电镜技术的概述
3
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒
三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
冷冻电镜技术
冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾1、电子显微镜成像技术的发展历史（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）：该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。
但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。
此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。
（2）上世纪60年代的三维重构技术三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。
因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。
显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。
在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。
（3）上世纪70年代的电子晶体学即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。
被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。
该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。
在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。
（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液中相同，呈天然状态。
因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。
2、冷冻电镜技术介绍（1）关于玻璃态冰：冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。
（2）操作步骤概要：冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求：应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。
此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A2，明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。
冷冻电镜技术
冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾1、电子显微镜成像技术的发展历史（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）:该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。
但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。
此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。
（2）上世纪60年代的三维重构技术三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。
因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。
显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。
在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。
（3）上世纪70年代的电子晶体学即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。
被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。
该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。
在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。
（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液中相同，呈天然状态。
因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。
2、冷冻电镜技术介绍（1）关于玻璃态冰：冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。
（2）操作步骤概要：冷冻包埋——转移至液氮或液氯中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求：应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。
此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A2,明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。
冷冻电镜技术
冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾1、电子显微镜成像技术的发展历史（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）：该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。
但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。
此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。
（2）上世纪60年代的三维重构技术三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。
因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。
显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。
在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。
（3）上世纪70年代的电子晶体学即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。
被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。
该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。
在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。
（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液中相同，呈天然状态。
因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。
2、冷冻电镜技术介绍（1）关于玻璃态冰：冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。
（2）操作步骤概要：冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求：应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。
此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A2，明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。
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生物电子显微技术
6、产生冰晶损伤的原因及排除方法 ▲原因：冷却速率不足；样品块过大 ▲排除方法： ①选择优质冷冻剂 ②使用最佳冷冻装置 ③剁碎样品 ④冷冻前用冷冻保护剂处理样品
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第二节 冷冻断裂(蚀刻)和复型技术
一 二 技术概况 基本原理
三
样品的制备
一、技术概况
（－）技术的特点
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l tg H l h M ( l L) M
h:颗粒高度 θ :投影角度 l:照片上投影长度 M:放大倍数 H:蒸发源的高度 L:蒸发源与样品的水平距离
2、二次投影 一次投影之后，将样品旋转180°， 再次投影
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3、旋转投影: 金属蒸发时,样品30～60转/min 适于：极小颗粒 金属投影的电镜图像样品的颗粒呈 黑色，投影区呈白色
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金属投影与日光投影的比较
二、复型技术
（一）、技术概述
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唯一一种能用TEM观察样品表面方法 1、适用范围: 金属材料,矿物质、化合物表面 坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、 孢子、花粉、木材 2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表 面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就是 样品表面结构的一个“模子”，称之为复型 （Replication)。
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1.蚀刻条件： 温度：－100～－110℃ 真空：1×10－5Torr 蚀刻速度：2nm/s 时间：15～90s 2.蚀刻速度的规则： 温度T↗ 蚀刻↗ 真空度↗蚀刻↗
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(四)复型原理： （＝2～2.5nm) 1、一般方法： 先45°喷Pt/C 2～5nm 后90 °喷C 7～15nm(加固) 2、复型的环境条件 真空优于5×10－5Torr 温度： －100℃ 3、间歇喷碳法： 喷1s,间歇3～4s,再喷1s,反 复4～5次，以防止热辐射损伤
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二、基本原理
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(一)分子生物膜结构的特性 1.生物膜的主要化学成分： 脂类（磷脂，胆固醇） 2.脂类分子的结构特点： 亲水的头部和疏水的尾部 3.脂类分子在水中三种排列： 小球分子团，脂双分子，层脂质体
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(二)断裂的原理 断裂总是沿着阻力最小平面进行的 即断裂总是从脂双分子层的疏水区 裂开 (三)蚀刻作用： 冷冻蚀刻： 样品断裂后，调控温度使之回升,断 裂面上冻结的冰直接升华为水而挥发， 从而暴露出更深一层结构的一种物理效 应。
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3、优点： ⑴ 分辨率极高，研究样品表面精 细结构； ⑵ 制样简单，不损伤样品，图像 具有立体感， ⑶ 在TEM下可以观察样品天然表 面或人工断面的细微结构特征。
（二）、制样方法
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1、一级复型 （负复型） 基本描述：先用有机材料直接在样品表面 印制复型，再将复型膜剥离样 品，金属投影来增加反差。 常用介质：0.5～1%火棉胶醋酸戊酯溶液 或0.5%formvar氯仿溶液 基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液→成膜→漂膜 →洗膜→捞膜→金属投影和喷碳 加固→观察 基本特点：分辨率高，20～50Å，人工假象少； 复型膜软，剥离时易变形，且不易 与样品分离
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(五)冷冻断裂仪简介 1.专用冷冻断裂及复型装置 EIKO ：FD-2A、FD-3 2.附件型装置： 真空喷镀仪＋冷冻断裂装置＋温 度控制器
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生物电子显微技术 三、冷冻断裂(蚀刻)和复型样品的制备
(一)技术准备： 1.电极的准备
2.样品冷冻前的预处理 ⑴取材：活体取下样品1mm3 ⑵预固定:1%-2%戊二醛固定液固定1－3小时
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3、结冰过程与结冰速率
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① 生物样品结冰过程： 细胞外结冰：结冰温度较高、速率低 细胞内结冰：结冰温度较低、速率高 ② 实验结果表明： 冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较 大冰晶，损伤细胞结构 冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同 时形成玻璃态冰，无损伤 ③ 结论: 防止冰晶形成的关键:提高冷却速率 （103 ～104℃/s） 、 降低冷冻温度
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（戊二醛固定液的温度为生理温度，彻底固 定后，冷却到4℃保存1－3h，在没彻底固定之 前保存在4℃下会引起膜脂质从细胞膜中分离 出来而造成人工假象。） ⑶漂洗：室温下PBS漂洗3次，10min／次
⑷冷冻保护：20－30％甘油等溶液渗透
8－24h
(二）操作步骤 1.冷冻
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第八章 电镜冷冻制样技术
生物电子显微技术
第一节 冷冻制样的基础知识
一 金属投影技术 二 复型技术 三 电镜冷冻制样技术概述
一 金属投影技术
生物电子显微技术
（一）发展概况： 1946,Willams建立金属投影技术，主要用 于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动 物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、 核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和 粉末材料。 1955，Hall,Huxley提出负染色技术； 1959,Horne和Brenner正式命名：Negative staining ，取代了金属投影技术。
生物电子显微技术
目前金属投影技术主要用于：观 察不适合负染色但需要金属投影来提 高反差的样品；可用于测量颗粒的大 小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善 粒子在TEM的可见性；是复型技术、 冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。
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（二）、金属投影基本概念及原理： 1. 金属投影技术的概念： 把具有高电子密度的金属材料（Pt， Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一 定的角度沉积在样品表面形成投影，从 而增加样品的反差，并使图像具有立体 感。
生物电子显微技术
(三)、冷冻断裂复型膜的命名
生物电子显微技术
(Branton,1975) 1.两个半膜: E半膜（外半膜）：连接细胞外空间及 细胞内空间(包括内质网腔、核周间隙、 线粒体内等)的半膜 P半膜（胞质半膜）：连接细胞质、核 质、线粒体和叶绿体基质的半膜 2.四个面： P半膜上的亲水面PS面（protoplasmic Surface) P半膜上的疏水面PF面（ protoplasmic fracture face) ES(extracellular),EF
4、冷冻剂（冷媒） 常用：液氮、液态丙烷、氟里昂、 液氦，液态乙烷
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冷冻速率↗冰晶直径↘冷冻损伤↘
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5、冷冻保护剂 ★目的：防止冰晶损伤 ★原理： 保护剂与水分结合，减少样品中 的水分，从而降低样品的冰冻点 ★常用的保护剂： 甘油、二甲基亚砜（DMSO）、 蔗糖、乙二醇
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C 、投影角度θ 的调整 调整原则：样品越细小，θ ↘， 如核酸5～9 ° ，细菌30 ° 病毒、噬菌体12－15°
注意：样品与蒸发源的直线距离>10cm
D、金属投影 先喷3s~4min,厚10~20nm 再 90 °垂直喷碳，加固
E、样品颗粒大小的测量
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生物电子显微技术
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病毒荚膜：负染色
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病毒荚膜：旋转投影
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病毒荚膜：金属投影
三、电镜冷冻制样技术概述
生物电子显微技术
(一)、冰冻制样技术的分类 冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片 冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等 (二)、特点： 1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态 2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减 少了样品超微结构和成分的损伤，有利 于保护生物大分子活性，用于组织化学、 细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、 尤其X－ray微区分析 3、操作步骤少，时间短，适于快速研究 与诊断
（三）、应用范围： 形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、
生物电子显微技术
放射自显影、尤其X－ray微区分析领域；
其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料 （四）、冰晶损伤： 1、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造 成的一种生物样品精细结构的损伤。 2、结冰过程： 0～－90℃ ： 六角型晶体 －90℃～－140 ℃： 立方体 低于－140 ℃：玻璃态无定形结构（非晶态）
将预处理后的样品装在冷冻蚀刻装置的样品 夹中， 直接冷冻或间接冷冻。
2.真空中断裂
5×10－5～1×10－5托，－100－－110℃
3.稍加热、蚀刻
样品温度从－110℃上升至－100 ℃，保持 15－90s
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4.喷镀覆型 45°投影喷铂，厚2－5nm，垂直喷碳 加固，10－20nm 5.复型膜和组织的分离： 腐蚀剂：动物：10～30％NaClO 植物：铬酸 6.清洗、打捞、干燥复型膜
生物电子显微技术
生物电子显微技术
2、预投影一级复型
基本描述：直接在样品表面进行金属投影
和喷碳，制成碳复型膜，再化
学法溶解掉样品，将复型膜打
捞在载网上。
典型方法：石蜡－铬预投影一级复型法
基本步骤：准备材料→喷铬喷碳→
石蜡补强→溶木材→脱蜡
生物电子显微技术
3、二级复型 （正复型）
生物电子显微技术
3. 所用仪器 真空镀膜仪：10－4～10－5Torr ⑴ 仪器结构
生物电子显微技术
真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电 极、金属电极）；样品台。 真空系统：两级泵真空系统，10－4～10－5 Torr 加热电流供给系统：大电流变压器，提高40－ 50A电流。
⑵ 真空的作用：
防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。 防止样品受到金属氧化而引起的污染。