水稻 花粉管通道法
水稻转基因育种的研究进展与应用现状
水稻转基因育种的研究进展与应用现状刘志宏1 田 媛2 陈红娜1 周志豪1 郑 洁2 杨晓怀1（1深圳市农业科技促进中心，广东深圳518000；2暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）摘要：随着生物技术发展的不断深入，我国水稻种业的发展也面临着全新的机遇和挑战。
目前，改善水稻品种质量的主要方法有分子标记技术、基因编辑技术和转基因技术。
其中，转基因水稻是利用生物技术手段将外源基因转入到目标水稻的基因组中，通过外源基因的表达，获得具有抗病、抗虫、抗除草剂等优良性状的水稻品种。
近年来，国内外在采用转基因技术进行水稻育种，提升水稻产量、改善水稻品质方面具有较多的研究进展。
在阐述转基因技术工作原理的基础上，概述国内外利用转基因技术在优质水稻育种方面的研究进展，进一步探究转基因技术在我国水稻育种领域的发展前景。
关键词：转基因育种；水稻；病虫害；除草剂Research Progress and Application Status of Rice Transgenic Breeding LIU Zhihong1，TIAN Yuan2，CHEN Hongna1，ZHOU Zhihao1，ZHENG Jie2，YANG Xiaohuai1（1Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，Guangdong；2Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）水稻（Oryza sativa L.）作为世界上重要的粮食作物之一，为世界超过1/3的人口提供了主粮，全球种植面积约1.4亿hm2[1]。
“十二五”以来，我国水稻产量连续稳定在2亿t以上[2]。
水稻作为我国的主要粮食作物，在我国粮食生产领域占据着十分重要的地位，水稻品种改良仍是保障种业持续发展和国家粮食安全的重点。
花粉管通道法
助细胞在花粉管伸长过程中的作用花粉管必须伸长才能进入胚囊，花粉管进入胚囊的方法有种种。 1. 从卵细胞与一个助细胞之间进入。 2. 从胚囊壁和一个助细胞之间进入。 3. 直接进入一个助细胞等。在某些种植物中，花粉管进入两个助细胞中的一个，在这一助细胞中释入出精核。用电子显微镜也确证了这种观察（ Schulz 等， 1968 ）。助细胞对于精核的进入是极为重要的。棉花中，一个助细胞在花粉管到达胚囊之前就开始退化。细胞器膜和液泡发生变化，细胞发生退化。在花粉管的顶端与助细胞的细胞质接触之前，花粉管不会开裂。从其细胞质的结构来看，认为花粉管的内含物需要在压力之下方能注入。受精前，各个助细胞的核及细胞质是正常的。但是一旦受精，其中一个助细胞的核及细胞质便发生变性，花粉管进入这一变性的助细胞之中。精核的释放不是在花粉管的尖端，而是在稍稍靠后的部位，管壁破裂而释放出精核。在这一瞬间，助细胞发生变化。助细胞的细胞壁消失，液泡缩小（Jensen ， 1968 ）。然后，花粉管将其中的营养核、两个精子和淀粉释放到助细胞中，被释放出的精子立即移动到已退化的助细胞的合点端。此后，精核进入卵细胞和中央细胞的细胞质，于是形成合子和胚乳核。已退化的营养核和助细胞核，在受精后仍残留在助细胞内。
植物转基因技术
植物基因工程南京中医药大学药学院陈建伟植物转基因技术植物基因转化方法n植物基因工程实验中，植物细胞只有经过 遗传转化才能获得转基因植株。
n已经发展了许多用于植物细胞的遗传转化 的方法，可分为三大类：n①载体介导法n②基因直接导入法n③种质系统法植物细胞的遗传转化的方法n①载体介导法，即将目的基因插入到根癌农杆菌的 质粒或病毒的DNA分子上，随着载体质粒或病毒 DNA的转移而转移。
共培养法及病毒介导法属于这 类方法。
n②基因直接导入法，指通过物理或化学方法直接将 外源目的基因导入植物细胞的方法。
n物理方法有基因枪法、电击法、超声波法、显微注 射法和激光微束法。
n化学方法有PEG法和脂质体法。
n③种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞浸染 法、胚囊和子房注射法。
几种常用方法介绍1、花粉管通道法n又称子房注射法、种质系统法。
最早由周光宇 等(1983)建立。
n此法是在植物授粉后，将外源DNA注入植物 子房的胎座位置，使DNA沿花粉管通道进入 胚囊，与受精卵或胚细胞接触而达到转化的目 的。
n这一方法的建立开创了整株活体植物转化的先 例，操作方便易行，避免了组织培养的麻烦， 在改良作物遗传性状的工作中有很大的潜力。
2、PEG介导法n PEG介导法为我国学者高国楠首创，是借助 化合物PEG、磷酸钙及高pH条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。
n PEG是细胞融合剂，可通过引起细胞膜表面 电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞间融合和外源DNA分子进入原生质体。
磷酸钙可与DNA结合形成DNA磷酸钙复合物而被原生质体摄入。
3、电击法n利用高压电脉冲的电击穿孔作用将质粒DNA 导入植物原生质体的方法称电击法。
此法起初 是应用于动物细胞。
n在植物细胞中进行基因转移是李宝健等在 1985年首创。
目前这一方法已广泛应用于双 子叶植物和单子叶植物。
n通过电击技术将基因直接导入带壁的植物细胞 或组织的方法称为电注射法。
基因工程的操作程序
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
将目的基因导入 微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程（1）.基因（2）.基因的构建方法
通过对受体菌的培养而储存基因 基因组的构建cDNA的构建-----反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
目的基因的mRNA
单链DNA
1
2
3
6
5
4
双链DNA (目的基因)
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件：
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。
此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。
最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。
我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。
1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。
相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。
目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。
在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。
侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。
山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。
由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。
随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。
由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。
基因工程----花粉管通道法原理
花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。
该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
1 花粉管通道法的生理学基础花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA 能沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。
这一技术原理可以应用于任何开花植物。
水稻是自花授粉作物，因此这种方法同样适用于水稻。
围绕着花粉管通道的形成是一个发生在植物花器结构中的传粉授精的过程。
从狭义上理解就象字面表明的那样，授粉是指从花粉被送到柱头上到在柱头上萌发的过程，实际上应该是一个以狭义授粉为中心的包括这一过程的非常复杂的生理现象，即包括花粉形成、传粉、花粉萌发、花粉管伸长以及继花粉管伸长之后的受精问题，甚至还包括拒绝受精现象。
被子植物的花器结构已研究得比较清楚，最外面的是子房，子房中有胚珠，它由外胚珠、内胚珠及珠心、珠孔、珠柄组成。
珠心内有8 核，近珠孔端有 3 个核，一个分化为卵细胞， 2 个分化为助细胞。
助细胞和卵细胞组合成卵器。
这三个细胞排列成三角形，各细胞都呈梨形，尖部朝着珠孔端。
近合点端的 3 个核分化为反足细胞。
胚囊的中央有两个极核，并和周围细胞质组成一个中央细胞。
因此典型的被子植物胚囊为8 核7 细胞胚囊，亦称为雌配子体，卵细胞称为雌配子。
雄配子体由含有大量淀粉的营养核和具有微管的两个精细胞、此外还有多糖类、线粒体组成。
植物开花以后，落在柱头上的花粉粒，被柱头分泌的粘液所粘住，以后花粉的内壁在萌发孔处向外突出并继续伸长，形成花粉管，这一过程，称作花粉粒的萌发。
植物遗传转化的替代方法及研究进展
万方数据３２生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２０１１年第７期物——水稻，经过处理后的小花结实率为２０％，转化效率高达４％。
采用花粉管通道法导人外源ＤＮＡ的方法有子房注射法和柱头滴注法，花器官较大的作物，如棉花可采用子房注射法；而花器官较小的作物，如水稻则采用柱头滴注法较好。
花粉管通道法的最大优点是不依赖于植物组织培养过程，避免了组织培养过程中可能产生的体细胞变异及基因型依赖性等问题，特别适合用于难以建立有效再生体系的植物以及可以把目的基因导入任何农艺性状优良的品种中；可以直接获得转基因种子，纯合速度快，节省育种时间，在农作物的分子育种中占有独到的优势¨１。
经过不断的技术改进，花粉管通道法可以满足规模化生产转基因植物的要求。
我国推广面积最大的转基因抗虫棉基本上就是花粉管通道法结合传统育种方法培育出来的。
已有研究结果表明，通过花粉管通道法获得的转基因植株外源基因多以多拷贝插入，而且插入的位置也具有随机性，在外源基因整合过程中染色体发生了转置、缺失等突变，致使转基因后代在表型上表现出变异。
刘冬梅等＂。
对花粉管通道法获得的棉花转基因后代的主要农艺性状进行了分析，转基因后代间的形态、生育期、产量和纤维品质等有显著的变化。
利用花粉管通道法获得的棉花转基因后代，其中仅有少部分符合孟德尔遗传分离定律，多数后代的遗传分离比例变化较大，存在着遗传分离多样性。
马盾等Ｈ’分析了通过花粉管通道法获得的棉花转基因后代中外源基因的稳定性，当转基因后代种植到Ｔ３一Ｔ４代时，有外源ＤＮＡ丢失现象，呈现出外源ＤＮＡ遗传不稳定性。
花粉管通道法的重复性较差，虽然已有利用花粉管通道法成功转化大豆的报道，但Ｓｈｏｕ¨１报道，利用花粉管通道法不能成功转化大豆；花粉管通道法的转化效率一般都非常低，利用基因枪法转化黑麦的转化效率是花粉管通道法的１０倍峥１。
１．２茎尖转化法１９８８年Ｕｌｉａｎｏ¨第一个采用茎尖转化法将含有卡那霉素基因以及Ｂ一葡糖苷酸酶基因导入矮牵牛，其转化效率与采用农杆菌介导法转化矮牵牛的转化效率大致相同，而且，此方法不经过组织培养阶段，从转化到生根仅用６周，可以节省大量的时间。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
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水稻花粉管通道法
摘要
水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。
本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。
一、引言
水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。
为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。
其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。
二、原理
花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。
在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。
此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。
三、技术流程
1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。
2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。
3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。
4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。
5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。
四、优缺点
1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。
此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。
2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。
此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。
五、应用前景
随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。
同时，
随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。
因此，在应用花粉管通道法进行水稻遗传改良时，需要充分考虑其潜在的环境和社会影响，确保其在满足人类需求的同时，不会对生态环境造成不良影响。