第五章分子生物学研究方法ppt课件
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现代分子生物实验技术PPT(上)
3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学PPT课件
顺式作用元件〔cis-acting element〕 反式作用因子〔trans-acting
element〕 真核生物启动子 增强子 转录因子〔trans-criptional factor,
TF) 转录过程
近启动子：〔核心启动子〕，－40～ ＋5，决定转录起始的准确位置。远启
动子：〔上游控制元件〕，－165～ －40，影响转录的频率。
膜受体介导的信息传递
cAMP -Ａ激酶 途径
磷脂酰肌醇途径
酪氨酸蛋白激酶 途径
胞内受体介导的信息传递
rRNA
RNA的加工成熟
tRNA mRNA
转录起始的选择 选择性加工 mRNA的稳定性
mRNA的构造 翻译的起始调节 可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始
调控 选择性翻译 小分子RNA的调控〔反义RNA、干
制 复制的过程
复制的保真性
复制的调控
定义
半保存复制 特点
类型〔线型、环状〕
参与DNA复制的物质
底物 模板 引物 DNA聚合酶 解链酶 引物酶 单链结合蛋白 拓扑异构酶 连接酶
复制起始 复制的过程 延伸
终止
复制起始点 复制方向 引发体的形成
DNApolⅠ和 Ⅲ的3′－5′活性 RNA引物起始复制，引物最终除去，
扰RNA、微小RNA、时序RNA〕 翻译的自我调节 翻译后程度的调控
谢谢
染色质构造对基因表达的影响 DNA的甲基化与去甲基化 染色体(质)丧失 基因扩增 基因重排
顺式作用元件 反式作用因子〔类型、构造〕 转录起始的调节〔转录起始复合物、
反式作用因子的活性、作用方式〕 RNA聚合酶 真核基因转录调控的主要形式 应答元件的作用机制 真核基因转录后程度上的调控
现代分子生物学ppt课件
• 翻译后的转运机制：细胞膜受体 • 核定位蛋白的转运机制：核定位序列 • 蛋白质的降解：蛋白酶水解、N端氨基酸影
响半衰期
第五章 分子生物学研究方法
知识要点
• 分子克隆技术的过程 • 分子杂交的概念 • PCR反应步骤
分子克隆RE、ligase • 重组DNA分子导入寄主细胞：细菌转化 • 重组体克隆的筛选：蓝白斑筛选、抗生素
第四章 生物信息的传递（下）
知识要点
• 三联体遗传密码 • tRNA的结构与功能 • 核糖体的结构与功能
• 蛋白质合成机制 • 蛋白质转运机制
遗传密码
• 遗传密码的破译 • 遗传密码的特性：无逗号、不重叠、通用
性、简并性、起始密码和终止密码
tRNA的结构与功能
• tRNA的二级结构：三叶草型——四环四臂 • tRNA的三级结构：倒L型 • tRNA的功能：密码子与反密码子的配对 • tRNA种类：起始tRNA与延伸tRNA、同工
C值矛盾
DNA结构
• DNA的一级结构 • DNA的二级结构——双螺旋模型
影响DNA二级结构稳定的因素 • DNA的高级结构——正超螺旋和负超螺旋
DNA复制
• 半保留复制 • 半不连续复制 • 复制的起点、方向和速度 • DNA聚合酶：原核 真核 • 原核生物和真核生物DNA复制的差别
第三章 生物信息的传递（上）
知识要点
• RNA转录过程和转录后加工 • 启动子与增强子、终止与抗终止 • 原核生物与真核生物mRNA的特征比较
RNA转录过程
• 不对称转录 • 原核生物RNA聚合酶：核心酶＋因子 • 真核生物RNA聚合酶：分类、特征、转录
产物 • 起始（启动子）、延伸、终止（终止信号）
原核与真核启动子的特征 增强子的概念和作用特点 终止和抗终止
响半衰期
第五章 分子生物学研究方法
知识要点
• 分子克隆技术的过程 • 分子杂交的概念 • PCR反应步骤
分子克隆RE、ligase • 重组DNA分子导入寄主细胞：细菌转化 • 重组体克隆的筛选：蓝白斑筛选、抗生素
第四章 生物信息的传递（下）
知识要点
• 三联体遗传密码 • tRNA的结构与功能 • 核糖体的结构与功能
• 蛋白质合成机制 • 蛋白质转运机制
遗传密码
• 遗传密码的破译 • 遗传密码的特性：无逗号、不重叠、通用
性、简并性、起始密码和终止密码
tRNA的结构与功能
• tRNA的二级结构：三叶草型——四环四臂 • tRNA的三级结构：倒L型 • tRNA的功能：密码子与反密码子的配对 • tRNA种类：起始tRNA与延伸tRNA、同工
C值矛盾
DNA结构
• DNA的一级结构 • DNA的二级结构——双螺旋模型
影响DNA二级结构稳定的因素 • DNA的高级结构——正超螺旋和负超螺旋
DNA复制
• 半保留复制 • 半不连续复制 • 复制的起点、方向和速度 • DNA聚合酶：原核 真核 • 原核生物和真核生物DNA复制的差别
第三章 生物信息的传递（上）
知识要点
• RNA转录过程和转录后加工 • 启动子与增强子、终止与抗终止 • 原核生物与真核生物mRNA的特征比较
RNA转录过程
• 不对称转录 • 原核生物RNA聚合酶：核心酶＋因子 • 真核生物RNA聚合酶：分类、特征、转录
产物 • 起始（启动子）、延伸、终止（终止信号）
原核与真核启动子的特征 增强子的概念和作用特点 终止和抗终止
分子生物学(共19张PPT)
04
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成与结构
氨基酸通过肽键连 接形成多肽链，即 蛋白质的一级结构 。
多条多肽链组合在 一起，形成蛋白质 的三级结构。
蛋白质的基本组成 单位是氨基酸，共 有20种常见氨基酸 。
多肽链经过盘绕、 折叠形成二级结构 ，主要形式包括α螺旋和β-折叠等。
在特定条件下，蛋 白质可形成四级结 构，由多个亚基组 成。
发展历程
从20世纪50年代DNA双螺旋结构 的发现开始，分子生物学经历了 飞速的发展，成为现代生命科学 中最为活跃和前沿的领域之一。
分子生物学的研究对象与任务
研究对象
主要包括DNA、RNA、蛋白质Байду номын сангаас生 物大分子，以及它们之间的相互作用 和调控机制。
研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相 互作用机制；阐明基因表达调控的分 子机制；探索生物大分子在生命过程 中的作用和意义。
转录因子
01
真核生物中存在大量转录因子，它们与DNA特定序列结合，激
活或抑制基因转录。
表观遗传学调控
02
通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式，改变染色质结构，影响
基因表达。
microRNA调控
03
microRNA是一类小分子RNA，通过与mRNA结合，抑制其翻
译或促进其降解，从而调节基因表达。
基因表达调控的分子机制
发育生物学研究生物体的发育过程，而分子 生物学则揭示了发育过程中基因表达和调控 的分子机制。
02
DNA的结构与功能
DNA的分子组成与结构
DNA的基本组成单位
脱氧核糖核苷酸，由磷酸、脱氧核糖 和碱基组成。
DNA的碱基
DNA的双螺旋结构
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
分子生物学ppt课件
基因组大小(Mb)
0.58 1.83 4.20 4.60 13.50 12.50 466 165 97 2700 3000
基因数
470 1743 4100 4288 6034 4929 30000 13601 18424 30000 25000
染色体数*
无 无 无 无 16 16 21 4 6 20 23
包括：
结构基因组学
功能基因组学
三个亚领域.
比较基因组学
28
29
一、病毒基因组 二、原核生物基因组 三、真核生物基因组
30
一、病毒基因组
基因组（genome） 1个配（精子或卵子），1个单倍 体细胞或1个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸 或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。
完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不 受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。
分子生物学
Molecular Biology
1
What is Molecular Biology?
分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。
核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。
医学分子生物学主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。
16
三、基因的结构特点和分类
基因的结构
结构基因：编码区序列（coding region sequence ）
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
转录调控序列：非编码序列（non-coding sequence）
基因表达需要的调控区（regulatory region）序列， 包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）等。
分子生物学课件(共51张PPT)
二级结构
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
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GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
.
5.1 重组DNA技术发展史
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶 ▪ T7¯DNA连接酶
.
5.1 重组DNA技术发展史
▪ 基因克隆(gene cloning) ▪ 分子克隆(molecular cloning)
.
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞
.
5.1 重组DNA技术发展史
2、重组DNA技术的基本步骤 ▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
第五章 分子生物学研究方法
5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术
.
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础
▪ 40年代明确了遗传的物质基础是DNA ▪ 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半
酶类 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶
多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶Ⅲ λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
功能 识别并在特定位点切开DNA
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中 的缺口 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合 成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端
▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，
从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
.
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶
.
5.1 重组DNA技术发展史
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
.
5.1 重组DNA技术发展史
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸
切除位于D史
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
.
5.1 重组DNA技术发展史
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
.
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.3重组DNA技术的概念
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。
保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 ▪ 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。
.
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基
▪ 1、DNA分子的切割与连接技术
▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。
.
5.1 重组DNA技术发展史
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
.
菌落原位杂交
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.5重组DNA技术的意义
目的基因的来源
原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA天然DNA（染色体 DNA、病毒DNA(噬菌 体DNA)、质粒DNA、 线粒体DNA和叶绿体 DNA）
人工合成及PCR扩增目的基因
.
5.1 重组DNA技术发展史
（八）重组实验中的主要载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。
.
5.1 重组DNA技术发展史
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设
计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
肽链而特意设计的载体称为表达载体。
.
5.1 重组DNA技术发展史
载体的选择标准
▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。
▪ 能自主复制； ▪ 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选
和鉴定； ▪ 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一
酶切位点，称为多克隆位点； ▪ 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
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5.1 重组DNA技术发展史
▪ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。
▪ T4¯DNA连接酶 ▪ EcoR I 连接酶 ▪ T7¯DNA连接酶
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5.1 重组DNA技术发展史
▪ 基因克隆(gene cloning) ▪ 分子克隆(molecular cloning)
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞
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5.1 重组DNA技术发展史
2、重组DNA技术的基本步骤 ▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
第五章 分子生物学研究方法
5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础
▪ 40年代明确了遗传的物质基础是DNA ▪ 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半
酶类 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ
反转录酶
多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶Ⅲ λ噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
功能 识别并在特定位点切开DNA
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中 的缺口 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合 成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端
▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，
从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶
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5.1 重组DNA技术发展史
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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5.1 重组DNA技术发展史
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸
切除位于D史
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
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5.1 重组DNA技术发展史
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.3重组DNA技术的概念
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。
保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 ▪ 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。
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5.1 重组DNA技术发展史
5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基
▪ 1、DNA分子的切割与连接技术
▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。
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5.1 重组DNA技术发展史
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
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菌落原位杂交
5.1 重组DNA技术发展史
5.1.5重组DNA技术的意义
目的基因的来源
原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA天然DNA（染色体 DNA、病毒DNA(噬菌 体DNA)、质粒DNA、 线粒体DNA和叶绿体 DNA）
人工合成及PCR扩增目的基因
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5.1 重组DNA技术发展史
（八）重组实验中的主要载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。
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5.1 重组DNA技术发展史
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设
计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
肽链而特意设计的载体称为表达载体。
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5.1 重组DNA技术发展史
载体的选择标准
▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。
▪ 能自主复制； ▪ 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选
和鉴定； ▪ 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一
酶切位点，称为多克隆位点； ▪ 分子量小，以容纳较大的外源DNA。