基因工程外源基因的表达培训课件.ppt

(2)trp启动子 trp启动子可从大肠杆菌的 色氨酸操纵子中分离。色氨酸操纵子结 构基因排列及其表达如图8-3所示。
(3)PL和PR启动子 PL和PR 启动子是指从 λ噬菌体中得到的一类启动子，它比lac 启动子活性高8-10倍。 λ噬菌体有自己 的一套阻遏物-操纵基因系统(图8-4)。
2．S-D序列
mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否
有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及SD序列与起始密码子AUG之间的距离。在原核
细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或
利用基因工程技术将真核基因转至原核生物 中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用 传统和常规方法不能或难以大量生产的有生 理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产 就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从 50万只羊脑中仅能提取出5mg，而现在用10L 的工程菌液即能提出来。用720kg猪胰脏只能 够提取出100mg胰岛素，而用2000L工程菌发 酵液即可得到同样量的胰岛素。从这些例子 中可以看到基因工程在应用方面的巨大潜力。
第九章 外源基因的表达
基因表达(gene expression)就是指某一基因指 导下的蛋白质合成，蛋白质是基因表达的产 物。
克隆基因表达方面的研究成果，对于某些研 究领域有着重要的用途。首先，它有可能为 揭示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的 研究手段。例如，运用重组DNA技术，能够 获得可在大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂 种干扰素的编码基因。这样，便可以将这种 蛋白质分子纯化出来，在体外进行生物学方 面的研究。
9.1.2 基因表达的调控序列
如上所述，由于原核和真核细胞中基因 表达的机制是不同的，因此必须详细了解基 因表达过程中的各种调控因子，构建高效的 表达载体，才能达到高效率、高水平表达外 源基因的目的。对原核生物来讲，基因表达 的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止 子、衰减子等序列。
1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶
基就从最左边的识别位点上解离下来。
(1)lac启动子 lac启动子是来自大肠杆 菌的乳糖操纵子。lac操纵子模型最初由 Jacob和Monod于1961年提出，它是DNA
分子上一段有方向的核苷酸顺序，即由 阻遏蛋白基因，(lac I)、启动基因(启动 子P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利 用有关的酶的结构基因所组成(图8-2)。
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。 操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的 结合，是一个基因表达的协同单位。调控区 主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动 子 (promotor)及其他有调控功能的部位。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻 译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染 色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA 后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成 蛋白质。
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
④原核基因一般不含有内含子(intron)， 在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系的直接控制要慢。 对RNA合成的控制有两种方式，一是起始控 制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上， 含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核 基因则缺乏此序列。
Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
-35区，位于转录起始位点上游35bp处， 故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为， -35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。 当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶 的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合 酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒， 并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚
(4)tac启动子 tac启动子是一组由非常强的trp 和lac启动子人工构建的杂合启动子。它比lac UV5启动子强7倍。其中tac I是由trp启动子的35和lac UV5的-10区构成；tacⅡ是由trp启动 子的-35区加上一个合成的46bpDNA片段(包括 Pribnow盒区)和lac基因所构成；tacl2是由trp的 -35区和lac的-10区，再加上lac操纵子中的操 纵基因部分和S-D序列融合而成的，它受1ac 阻遏蛋白的负调控，并被IPTG诱导。
9.1 外源基因在原核细胞中的表达
9.1.1 原核生物基因表达的特点
同所有的生命过程一样，外源基因在原 核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA 转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。与真核 细胞相比，原核细胞的表达有以下特点：
①原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细 胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。
欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑 表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启 动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统 等基本条件，也就是说必须满足以下条件：
①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并
指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②外源 基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用 cDNA 或 全 化 学 合 成 基 因 ， 而 不 能 用 基 因 组 DNA(genomic DNA)；③必须利用原核细胞的 强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因 的表达；④外源基因与表达载体连接后，必 须 形 成 正 确 的 开 放 阅 读 框 架 (open reading frame)；⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源 基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿 主菌的毒害。