大鼠肝移植过程图

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大鼠肝细胞微球皮下移植生成肝组织初探

大鼠肝细胞微球皮下移植生成肝组织初探张兰;李则学;刘海亮;李沛雨【摘要】目的探讨大鼠肝细胞微球皮下移植生成肝组织的可行性，为构建组织工程肝寻找新的方法。

方法新鲜分离的SD大鼠肝细胞接种在琼脂糖包被的培养皿上进行培养，待其形成肝细胞微球后采用直接注射方式植入大鼠腹股沟处皮下腔。

1 周后取腹股沟处组织，HE 染色法观察生成的肝组织形态。

结果体外培养3 d，肝细胞形成致密的肝细胞微球，直径大小在43 ～ 185 μm，HE 染色显示微球中的肝细胞保持天然肝细胞形态特征。

将其植入大鼠腹股沟处皮下腔1 周，HE 染色显示植入的肝细胞成活，并呈三维肝样组织团，肝细胞保持其特有形态特征：胞体为圆形，核大而圆，多为双核。

结论肝细胞微球皮下移植可形成肝组织，为组织工程肝的构建创建了新的方法。

【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2014(035)005【总页数】3页(P493-495)【关键词】工程化肝组织;肝细胞微球;组织工程【作者】张兰;李则学;刘海亮;李沛雨【作者单位】解放军总医院普通外科研究所,北京100853;;;;【正文语种】中文【中图分类】R318.1对于先天性肝代谢紊乱及终末期肝病所致的急、慢性肝功能衰竭，肝移植是目前唯一有效的救治手段，但供体短缺严重制约该技术广泛应用[1-2]。

肝组织工程技术的发展为各种肝病治疗提供一种潜在方法[1-4]。

通过创建可植入工程化肝移植物体内再生工程化肝组织可为病损肝脏提供肝功能支持或直接对其进行修复[5-6]。

迄今为止已证实包括肝细胞/支架材料复合物、肝细胞片层等多种肝移植物体内植入后可再生有功能的工程化组织[7-12]。

肝细胞微球是肝细胞在非贴壁培养过程中相互聚集形成的三维类组织样细胞聚集体；体外研究表明肝细胞在形成微球后可更好的保持其活性和功能[13-15]，但尚未见将其用于体内构建组织工程肝的报道。

本研究旨在评价肝细胞微球皮下移植形成肝组织的可行性。

大鼠减体积肝移植术后早期死亡的原因分析

ａ．ＴｅｎＤｐｒｅｔｆＨｐｔｂｉｒｐｎｒｔｕｇｒ，ＧｎｅＡｉａｄＨｓｉｌＫｎｎｄａＣｌｇ，Ｋｎ１ｈ￡ｅａｔｎｅａｏ— ｉａｙ－ａｃａｉＳｒｅｍｏｌｅｃｙａｍｉｆｌｔｏｔｕｍｉＭｅｉｌｏｌｅｕ — ｉｅｐａｏｆｇｃｅ
ｏｓｕｔｎ（．％）ｇｓｅｂｌｍ（．％）ｌｅｄｓｎｔｎ（．％）ｎｕｏｏａ（．％）ｐｌｏａｎｅｔｎｂｔｃｏ２４ｒｉ，ａｍｏｓｉ１８，ｉｒｙｆｃｏ１８，ｐｅｍｔｒｖｕｉｈｘ１８，ｕｍｎｒｉｆｉｙｃｏ
（．％）ａｄｅｃｓｉｅａｉｇ（．％）ＣｎｌｓｎＴｅｃｍｏｅｔａｙｄａａｓｏｔｅｕｅ１２ｎｘｅｓｅｒｗｒｎ１２．ｏｃｉｈｏｍｎｓｅｒｅｔｃｕｅｆａｒｄｃｄ—ｓｅｌｅａｓｖｍｕｏｌｈｒｉｖｒｎ — ｚｉｔｒ
ｕｉｒｖｄｏｅａｉｎ，ａｄ１０ｒｃｉｅｍｐｏｅ．Ｒｅｕｔｎｍｐｏｅｐｒｔｏｎ（ｅｅｖｄｉｒｖｄ３ｓｌｓＴｎｙ— ｆｅｏ７ａｓｈｖｎｅｅｖｄｒｄｃｄ— ｓｚｉｅｗｅｔｉｆ１０ｒｔａｉｇｒｃｉｅｅｕｅｖｉｅｌｒｖ
布为：腹腔出血８只（．％）４７，肠梗阻４只（．％）气体栓塞３只（．％）２４，１８，肝功能不良３只（．％）１８，气胸３只

大鼠原位肝移植模型建立的技术要点

大鼠原位肝移植模型建立的技术要点目的探讨大鼠肝移植手术技巧与处理要点, 减少术后并发症，建立稳定的大鼠肝移植模型。

方法Wistar大鼠240只（供受体各120只）行二袖套法原位肝移植。

结果120例大鼠原位肝移植术后48小时存活率88.3 % ,1周存活率86.7%，建立了稳定的大鼠肝移植模型。

结论掌握技术要点与处理方法，是建立稳定的大鼠肝移植模型的保证。

Abstract：ObjectiveTo explore the surgical skills of Orthotopic Liver Transplantation in Rats and reduce the complications. MethodsOrthotopic Liver Transplantation was performed in 240 rats using two-cuff technique.ResultsThe survival rate for 48 hours was 88.3 %, the survival rate for one week was 86.7 %, and established stable liver transplantation model in rats. ConclusionMaster the surgical skills of Liver Transplantation in rats can improve achievement ratio and the steady livability of rats with orthotopic liver transplantation．Key words：Liver transplantation；Model；Rats大鼠原位肝移植是研究免疫耐受、免疫排斥、器官保存、肝脏缺血再灌注损伤等方面常用动物模型，1979年Kamada首次提出了二袖套法建立大鼠肝移植模型，简化了手术方式，提高了生存率[1]。

单人行大鼠原位肝移植手术难点及技巧的探讨

ｃｐｏｐｒｔｎｔｎｎｅａｉｔｍｅｗｅｅ（７２ ± １０）ｍｉＳ（６４土１１）ｍｉｅｔｒｏｅａｉｉａｄａｈｐｔｉｒ２．２ｏｍｅｅ．３ｎＶ２．７．６ｎ，（Ｏ５士３１）ｍｉＳ（８１ ± ５．８．ＯｎＶ４．８３７）ｍｉ，（１６．０ｎ１．Ｏ士０１）ｍｉＳ（１２士００）ｍｉ．Ｔｈｕｃｓｆｌｒｔ，ｏｅｗｅｋｓｒｉａａｅｏｅｍｏｔｕｖｖｌ．１ｎＶ１．８．８ｎｅｓｃｅｓｕａｅｎ－ｅｕｖｖｌｒｔ，ｎ－ｎｈｓｒｉａ
福建医药杂志２１００年６月第３２卷第３期
ＦｊｎＭｅ，Ｊｎ００ｕｉｄＪｕｅ２１，Ｖｏ３，Ｎｏａｌ２．
６３
单人行大鼠原位肝移植手术难点及技巧的探讨
福建医科大学第一临床医学院肝病中心（州３００）黄启明吴燕斌福５０５刘景丰邱明链
ｅａｉｇｄｆｉｕｔｓａｄｔｃｎｑｅ．ＭｅｈｄＡｏａｆ０ｄｌｌＤａｓｗｅｅａｏｔｄＴｈｄｌｓｅｔｂｉｈｄｗｉｅｒｔｎｉｆｌｅｎｅｈｉｕｓｃｉｔｏｓｔｔｌ０ａｕｔｍａｅＳｒｔｒｄｐｅ．ｅｍｏｅｏ２ｗａｓａｌｅｔｒ — ｓｈｆｒｄｔ — ｕｆｍｅｈｄｂｉｇｅｏｅａｏｎｏｂｅｏｅａｏｓＦｉｙｃｓｓｏａｒｈｔｐｃｌｅｒｎｐａｔｔｎｒｅ — ｏｍｅＷＯｃｆｔｏｙｓｎｌｐｒｔｒａｄｄｕｌｐｒｔｒ．ｆａｅｆｒｔｏｔｏｏｉｉｒｔａｓｌｎａｉｓｗｅｅｐｒｔｖｏｆｒｄｗｉｎｉｅｙａｈｇｏｐＲｅｕｔＩｉｇｅｏｅａｏｒｕｎｏｂｅｏｅａｏｓｇｏｐ，ｄｎｒｏｅａｉｎｔｍｅｒ — ｏｍｅｔｕａｄｄｅｅｅｃｒｕ．ｈｓｌｓｎｓｎｌｐｒｔｒｇｏｐａｄｄｕｌｐｒｔｒｒｕｏｏｐｒｔｉ，ｅｏ

大鼠原位肝移植模型的研究进展

症等几个方面仍需要进行大量的研究，稳定的动物实验模型的建立就故
显得至关重要，是研究这些问题的有效途径Ｌ。与其他实验动物相比，２］大鼠具有解剖结构类似于人类，易饲养，殖较快，于观察等优点，容繁便故大鼠肝移植模型是目前基础与临床中最常用的动物模型。大鼠肝移植术式模型大体的分型有大鼠原位肝移植；鼠异位肝移植；鼠慢性大大排斥反应的建立；他的模型（体积式、助性原位部分、心跳供体其减辅无等）３。本文仅对大鼠的原位肝移植实验研究的进展作一综述Ｌ］１大鼠模型的优点基础和临床的肝移植模型主要以鼠为造模对象，鼠原位肝移植模大型是目前最常用的动物模型。ＲＯＴＭ主要有以下优点：与较大的实Ｌ ① 验动物（、）比，管肝移植实验在技术上更容易实施，得益于显狗猪相尽但微外科的发展，助手术显微镜的放大，借使用精细的显微手术器械及缝合材料（管）对细小的组织进行精细手术，ＲＴＭ的建立成为可套，使ＯＬ能［。②有大批基因型明确的纯系大鼠供我们选择，近交系动物、Ｉ］如封闭群和杂交群等。③单克隆抗体可以特异和灵敏的鉴定大鼠在免疫排斥异以及免疫耐受方面起重要作用的淋巴细胞，们目前对大鼠的免疫人分子的认识越来越多。④ 大鼠繁殖快（娠期和哺乳期较短）成本低、妊、易于饲养、有较强的抗病能力，人的解剖结构类似。⑤ 建立的模型具和具有良好的重复性，济性，经并发症与大动物肝脏移植基本相同。２大鼠的麻醉动物模型的建立是在动物的麻醉状态下进行的，模型的建立过程在中，凡是能影响麻醉效果的因素都会对模型的存活率和成功率造成影响Ｉ。由于每种动物对不同麻醉药的反应，ｓ］以及不同剂量的维持效果不同，故在动物的麻醉过程中，应选择对动物机体影响较小、作用持续时间短，而且对实验结果影响小的的麻醉剂，而达到维持稳定的麻醉效果。从大鼠原位肝移植模型，麻醉用药的选择及麻醉深度的掌握是保证手术顺利进行的关键之一，时也是减少大鼠术中及围手术期死亡率的关键因同素之一。目前用于大鼠肝移植模型手术的麻醉药物种类较多，要有乙主醚、氯胺酮和戊巴比妥等，种麻醉药有各自的优缺点和应用范围Ｌ。每６Ｊ２１麻醉药的使用情况：鼠肝移植模型建立过程中，．大目前主要使用乙醚和氯胺酮两种麻醉剂。乙醚采用吸人式给药，由于其对呼吸道的刺激作用，造成呼吸困难甚至窒息，会因此在给药前，行肌注阿托品的要预处理Ｌ。氯胺酮，７Ｊ化学名是２（一氯苯基）一２一２甲胺基一环己酮盐酸盐，Ｄｍｉ９５年引入临床后，自ｏｎ１６ｏ至今仍是非巴比妥类静脉麻醉药镇痛效果唯一确定的麻醉药［巴比妥类麻醉药目前仍在大鼠肝移植模型的建立中使用。因其比较大的肝脏毒性，严重影响肝脏的功能和但会实验结果，故很少使用。彭勇［等在用改进的二袖套法制作大鼠模型的。］过程中，大鼠随机分为对照组、醚组、氯胺酮组、合氯醛组巴将乙水戊比妥组，观察每种麻醉剂的麻醉过程、大鼠生理和肝功能的影响以及对无肝期开始后的死亡率，出各种麻醉对肝移植大鼠均有明显影响，得但乙醚具有对生理、功影响小，肝期开始后死亡率低的优点，可作为肝无故制作大鼠原位肝移植模型的首选麻醉方法。国内外许多文献报导，氯胺酮在大鼠肝移植中的麻醉多见于供体，受体多用乙醚。就其原因，而是由于大鼠肝移植要经历无肝期这一特殊过程，肝 ��

大鼠原位肝移植可控性胆道外引流模型的建立

Ｏｎｅｈｎｄｅｏｒｔｏｒｔｏｔｏｏｃｆｖｒｕｒｄｎｅａｓｆａｓｒｈｔｐｉｉｅ
【ｂｒｃＯｊｔｅＴｅｅｐａｄａｃｄｃｎｏａｌｂｉｙｔｃｅｔｎｌｒｎｇａＡｓａｔｔ】ｂｃｖｏｄｖｌｎａｖｎｅｏｔｌｂｉａａｔｘｒａｄｉｅｉｒｓｅｉｏｒｌｅｌｒｒｅａａｎｔ
肝循环，且提高了术后生存率，于术后胆道管理。而便
【关键词】肝移植；胆道；引流术；模型，ｙ
ＣｎｒｌｂｅｂｌｒａｔｘｅｎｌｒｉａｅｉａｓｒｏｏｉｌｅａｓｌｎａｉｎｍｏｅＱＵＭｉｇｏｔｏｌｌｉａｙｔｃｅｔｒａｄａｎｇｒｔｏｔｔｐｃｉｒｒｎｐａｔｔｄｌＩｎ — ａｉｒｎｈｖｔｏ
ＦｒｏｉｌｆｌｔｕａｄｃｌｎｖｓｙＦｚｏ５０５ＣｉａｉｔｓｔｆｉｅｔＦｊｎＭｅｉｉｒｔ，ｕｈｕ３００，ｈｓＨｐａＡａｄｏｉｉａＵｅｉｎＣｒｓｏｄｎｕｈｒｏｒｐｎｉｇａｔｏ：ｅＪｎ－ｎＥａｌｄｉｇｅｇａｏ．ｏ．ｎｉｆｇ，ｍｉｌｎｎ＠ｙｈｏｃｒｃｇｅ：ｊｆｎ
【摘要】目的制作大鼠原位肝移植可控性胆道外引流模型。方法将１０只原位肝移植大１
鼠随机分为实验组７Ｏ只，制作可控性的胆道外引流回流通路；照组４对Ｏ只，进行二袖套法大鼠原位肝移植并制作单纯的胆道外引流。术后进行胆汁检测及生存评估。结果术后４周，实验组大鼠的胆汁分泌量、汁酸总量及胆汁中ＣＤＡ和ＣＣ胆Ａ、ＣＤＡ所占的比重均高于对照组（Ｐ值分别为００５．２、００４００６００９及００１。实验组４周生存率为８．％，．１、．０、．２．０）５７对照组为５．％；５Ｏ生存分析示两组差异有统计学意义（００８。结论Ｐ：．１）该大鼠原位肝移植可控性胆道外引流模型，不但维持了大鼠的肠

大鼠30%小体积肝移植模型两种切肝方法的比较

（ｆｌｔｏｉｌｆＸｚｏｄｃｌｏｅｅＸｚｏ２０２Ｐ．Ｃｉａ１ＡｉｅＨｓｔｕｈｕＭｅｉｌｇ，ｕｈｕ２１０，．Ｒｈｎ）ｉａｄｐａｏａＣｌ
Ａｓａｔｂｔｃ：０ｂｅｔｅＴｓｂｉｎｅｅｔｅａｄａａａｌ３％ｓｌｆｒｉａｌｅｔｎｐｎａｏｏｅ．ｒｊｃｉｏｅｔｌｈａｆｃｖｎｖｉｂｅ０ｖａｓｆｉｌｍａ — —ｚｒｔｉｒｒｓｌｔｔｎｍｄ１ｌｏｓｅｖａａｉ
ｌｅｃｕａｂｄｔａｇｂｒｆｇｏｐＢ（４）３％ｌｅａｓｌｔｔｎｕｉｇａｍｄａｂｒｔｈｅ— ｏ，ａｄｔｌｅｎｌｌｅａ；ｒｕｎ＝０，０ｂｅｏａｒｎｉｅｏｇｔｉｒｒｎｐａａｏｓｅｉｌｅｇａ．Ｔｒｖｔｎｉｎｎｏｆｅ
山东医药２１年第５卷第５０１１２期
大鼠３％小体积肝移植模型两种切肝０方法的比较
宋军。丁志龙徐，，为李文美李向农王学浩，，，
（１徐州医学院附属医院，苏徐州２１０；Ｉ江２０２２南京医科大学第一附属医院）
ｃｏｓｓｃｉｎｂｅｄｎ，ｂｌｅｋｇｎｎｅｔｎｓｏｄｎｉｎｆａｔｄｆｒｎｅ．ＣｏｃｕｉｎＵｉｇｉｒｖｄｍｅｈｄｒｓ —ｅｔｌｅｉｇｉｌａａｅａｄｉｆｃｉｈｗｅｏｓｇｉｃｎｉｅｅｃｓｏｅｏｉｆｎｌｓｏｓｎｍｐｏｅｔｏｏｂｅｅｔｎｒｉｂｅａｄｅｅｔｅ３％ｓｌｆｒｓｚａｉｅａｓｌｎａｉｎｍｏｅｉｇｔｌｂ．ｃｕａｅｆｌｅｒｓｃｉ，ａｍｏｅｖａｌｎｆｃｉ０ｏｏｖｍａ１ —ｉｅｒｔｖｒｔｎｐａｔｔｄｌｗｔａｒｈｏｅａｄｔ．ｏｌｒｏｈｉ

大鼠原代肝细胞的标记和移植方法

大鼠原代肝细胞的标记和移植方法杨军英;王建设;刘慧兵;李涛;刘芳【摘要】The optimum concentration of CM-DiI incubated with primary hepatocyte of rat , optimum transplant volume and route of labeled primary hepatocyte are studied . The rat hepatocytes are isolated and purified by collagenase and density gradient centrifugation , and labeled with different concentration of CM-DiI , and then transplanted on rat which are previously suffered 2/3 partial hepatectomy 0 h by liver portal vein and tail vein , respectively . The livers are removed after transplanting hepatocyte 36 h , frozen section and paraffin section are prepared and analyzed by immunohistochemistry and fluorescence observation , respectively . The results show that hepatocyte can be labeled to 95% after incubating with CM-DiI 4 μmol・mL - 1 for 5 min , labeled hepatocytes which are observed on frozen section transplanted by 0.8 mL per keilogram remnant liver weight are more than that of 0.2 ,0.4 and 0.6 mL (P < 0.01) , and labeled hepatocytes transplanted by liver portal vein aremore than that of tail vein ( P < 0.01 ) . Hepatocytes incubated with CM-DiI 4 μmol・mL - 1 for 5 min can be labeled to 95% , and 0.8 mL labeled hepatocytes per keilogram remnant liver weight transplanted by liver portal vein can get preferable label and transplantation efficiency .%探讨CM-DiI 标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度、细胞的移植量和移植途径．采用原位胶原酶灌注和密度梯度离心法分离、纯化大鼠肝细胞，用不同浓度 CM-DiI 进行标记，筛选出 CM-DiI 的最佳标记浓度，分别从门静脉、尾静脉移植到2/3肝切除0 h大鼠，对细胞移植36 h 后的肝组织石蜡切片和冰冻切片分别进行免疫组织化学分析和荧光观察．结果显示，4μmol・mL -1浓度的CM-DiI 和肝细胞孵育5 min ，细胞标记率高达95％．每克大鼠残肝移植0.8 mL的细胞悬液（107个・mL -1）和0.2，0.4，0.6 mL 移植后检测到的标记细胞数目相比有显著性差异（P＜0.01），经肝门静脉移植后可以检测到的标记细胞数比尾静脉多（P＜0.01）．CM-DiI 标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度为4μmol・mL -1，标记细胞的最佳移植量为每克大鼠残肝移植0.8 mL 的细胞悬液（107个・mL -1）、最佳移植途径为经肝门静脉移植．【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】5页(P79-83)【关键词】大鼠;原代肝细胞;细胞移植;标记率;移植途径【作者】杨军英;王建设;刘慧兵;李涛;刘芳【作者单位】河南师范大学体育学院，河南新乡 453007; 河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007;河南师范大学体育学院，河南新乡 453007;河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007;河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007;河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007【正文语种】中文【中图分类】Q2-33细胞治疗在修复肝损伤、促进肝再生、改善肝功能的作用已经在体外研究和动物实验中得到越来越多令人欣喜的结果，但其作用机制、临床疗效还需要深入研究[1,2].目前，大多研究采用间充质干细胞、IPS细胞等诱导成 hepotocyte-like cell 治疗肝脏疾病[3,4]，但其在体内是否可以维持内环境稳定，不会诱发肿瘤需要长期试验来证实.肝脏具有极强的再生能力.当受到急性损伤时，残余肝脏细胞能够迅速增生恢复至原肝重，维持正常的肝脏生理功能[5].因此，肝细胞是肝脏的主要结构和功能细胞，也是肝损伤修复的第一道屏障[6]，是肝脏疾病治疗的重要细胞[7,8].本研究采用大鼠2/3肝切除模型，用荧光染料CM-DiI标记，对再生肝细胞的体外标记、移植途径和体内分布进行检测，为肝细胞的细胞治疗和体内分化研究提供实验基础.1 材料与方法1.1 实验动物及模型制备成年健康 SD 大鼠由河南师范大学实验动物中心提供.体重(220±20)g，饲养温度(21±2)℃，相对湿度60%±10%，光照时间12 h(8：00～20：00)，自由饮水、摄食.大鼠用乙醚麻醉、酒精消毒后，按文献[9]方法切除大鼠的肝脏左叶和中叶，制备2/3肝切除大鼠模型.本实验均在无菌条件下进行.1.2 仪器和试剂荧光显微镜、冰冻切片机、切片机、低温离心机等.Percoll(Pharmacia公司)，羊抗鼠 ALB 单克隆抗体(Santa公司)，兔抗鼠G6P 单克隆抗体、鼠抗羊 IgG 试剂盒、鼠抗兔 IgG 试剂盒(博士德公司)，碱性磷酸酶标记山羊抗兔二抗、碱性磷酸酶标记兔抗山羊二抗(北京中杉公司)，CellTrackerTM CM-DiI(Invitrogen公司)，Ⅳ 型胶原酶(Collage nase Type Ⅳ，Sigma 公司)，其他化学药品均为分析纯.1.3 肝细胞分离水合氯醛麻醉正常大鼠，腹部用酒精消毒，采用原位胶原酶灌注和密度梯度离心法，参照文献方法[10]，分离获得肝脏细胞悬液.将肝脏细胞悬液和60% Perco11在4℃、200 g密度梯度离心15 min，收集中间层细胞(即肝细胞).台盼蓝染色，镜检细胞形态和活性.当细胞收率≥90%，细胞活性≥96%，红细胞数量≤0.1%时，视为合格样品.1.4 细胞免疫化学分离纯化的肝细胞悬液用4%多聚甲醛固定30 min后涂片，参照细胞免疫化学方法，DAB染色，检测ALB和G6P的表达.1.5 肝细胞标记将分离纯化的肝细胞悬液调整密度至1×106 mL-1，分别用 CM-DiI(二甲基亚砜事先溶解好，浓度为1 mg·mL-1) 1～5 μL·mL-1 5个梯度标记细胞，37 ℃分别孵育2,5,10 和 15 min，随后将细胞置于4 ℃ 下 5 min 以终止反应，用4 ℃预冷的D-PBS溶液50 g洗涤3次，去除残余标记液.取10 μL细胞悬液滴片，荧光显微镜下检测标记率.1.6 细胞移植按每克大鼠残肝移植0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mL的细胞液，以1 mL·min-1的速度，用0.7 mm直径针头的注射器，将标记好的细胞悬液(1×107 mL-1)分别从尾静脉和门静脉移植入2/3肝切除0 h的大鼠.对照组注入等量PBS.1.7 细胞示踪于细胞移植后36 h处死大鼠，摘取肝脏，制备6 μm冰冻切片，荧光显微镜观察移植肝细胞在肝脏内的分布情况；用10%福尔马林溶液固定肝脏，制备石蜡切片.按照免疫组织化学方法，DAB显色，镜检ALB 的表达.1.8 统计学分析数据处理采用 SPSS 15.0 软件，实验结果数值采用t检验.P<0.05即为有统计学意义.2 结果2.1 再生肝细胞的形态学特征通过两步法原位灌流消化获得肝细胞的活性高达95%以上，细胞分散较好，轮廓清晰，大小均一，折光性强，胞质清亮，核大而圆，核仁清晰，有双核细胞.肝细胞纯度较高，G6P和ALB阳性细胞率均在95%以上(图1).2.2 CM-DiI标记细胞的最佳浓度和时间分离纯化的1×106 mL-1的肝细胞和CM-DiI储备液在37 ℃条件孵育.CM-DiI在2～4 μL·mL-1浓度范围内，标记率随浓度增加而升高，4 μL·mL-1浓度时标记率达95%以上.各实验组间差异显著(P<0.01).孵育 5 min标记率和细胞活性最好，随着孵育时间延长,细胞活性降低(图 2,3).图1 原代肝细胞 ALB(A)和G6P(B)的表达(×200)Fig 1 Expression of ALB(A) and G6P(B) in primary hepatocyte(×200)A～E分别为CM-DiI 1，2,3,4，5 μL·mL-1标记的肝细胞(A～E: Hepatocyte labeled by 1,2,3,4,5 μL·mL-1 CM-DiI,respectively)图2 不同浓度CM-DiI标记原代肝细胞(×200)Fig 2 Primary hepatocyte labeled by different concentration CM-DiI(×200)图3 冰冻切片检测到的标记细胞和移植细胞数量的关系Fig 3 The relationship between labeled hepatocyte observed on frozen section and the numbersof transplanted hepatocyte2.3 肝细胞移植的最佳量细胞移植后 36 h，受体动物肝脏的连续冰冻切片结果显示(图4)，移植细胞量少时，在组织切片中基本看不到，可以追踪到的细胞数目随着移植细胞数量的增加而增加.1×107mL-1密度的标记细胞按0.8 mL·g-1残肝移植检测效果最好，和0.2,0.4,0.6和1.0 mL·g-1残肝的细胞移植量相比具有显著性差异(P<0.01)，和1.0 mL·g-1残肝的细胞移植量相比没有显著性差异.2.4 移植途径细胞移植后36 h受体动物肝脏的连续冰冻切片的免疫组化和荧光结果显示(图5)，经肝门静脉和尾静脉两种方式移植，在肝组织内均可检测到移植细胞.相同密度和数量的肝细胞，经肝门静脉移植检测到的标记细胞明显多于尾静脉移植(P<0.01). 图4 冰冻切片检测到的标记细胞和移植途径的关系Fig 4 The relationship between labeled hepatocyte observed by IHC and transplantation route2.5 受体肝的组织学检测细胞移植后36 h受体动物肝脏组织学结果显示(图5)，肝细胞轮廓清晰，胞质均匀，可见部分双核细胞，细胞核呈圆形或椭圆形，个体较大，易于辨别.个别移植细胞在受体肝脏中可以表达ALB.3 讨论目前治疗肝癌或终末期肝病的理想方案是肝移植，但是供肝严重不足和免疫排斥阻碍了其广泛应用.原代肝细胞的移植避免了干细胞和iPSCs细胞的潜在危险，实现了一个供肝用于多个受体，具有费用低，可重复移植、创伤小等优点[11]，既是终末期肝病和肝移植之间的桥梁，又可以作为基因治疗的载体，纠正遗传代谢性肝病的代谢紊乱.A.HE染色；B和D.荧光显微镜下观察到的标记细胞；C.ALB表达.箭头指的是受体肝内表达ALB的移植细胞(A.HE staining；B and beled hepatocyte observed by fluorescence observation microscope;C.Expression ofALB.Arrow indicated transplatated hepatocyte which expressed ALB inreceiver liver).图5 受体肝组织的组织形态学检测Fig 5 Morphology observation in receiver liver肝细胞移植常采用门静脉肝内移植、尾静脉移植、穿刺脾实质内移植、经肝动脉肝内移植以及腹腔内大小网膜腔内移植或皮下注射等途径[12,13].静脉内输注的细胞会回归到肝脏，是一种简便而又安全的输注途径.部分肝切除后，肝再生被启动，细胞增殖、分化相关的一些生长因子、细胞因子等通过激活细胞信号通路[10]，为移植细胞提供良好的再生环境，可促进移植细胞的存活、驻留、增殖和分化.我们采用部分肝切除模型大鼠作为受体，采取门静脉和尾静脉两种方式植入原代肝细胞，通过荧光追踪，发现相同密度和数量的肝细胞，经肝门静脉移植后可以检测到较多的标记细胞.CM-DiI是一种细胞膜标记染料，水溶性好，标记细胞形态良好，对细胞无毒，稳定长效，其荧光不受醛类固定剂影响，能有效用于体外诱导分化和移植细胞在活体组织中的迁移及分化研究.但CM-DiI标记基本都是用于干细胞研究，对于原代细胞的标记未见报道.研究发现，移植细胞数量级不得超过 107 个，移植量在 0.5～3.0 mL范围内.移植细胞的数量增加1倍，门脉高压引起的右心房压力升高，并发症如呼吸暂停或死亡明显增多[13].本研究中，把分离纯化的肝细胞移植到2/3肝切除大鼠，通过细胞移植后36 h受体动物肝脏的连续冰冻切片和石蜡切片的观察，发现4 μmol·mL-1浓度的CM-DiI和肝细胞孵育5 min，按每克大鼠残肝0.8 mL 的细胞悬液(107个·mL-1)移植，可以达到最好的标记效率和移植效果.把分离纯化的肝细胞移植到再生肝后，细胞散在分布于肝内，细胞结构完整，部分标记细胞嵌入肝板，具有肝细胞形态，极个别移植细胞能够表达ALB，具有肝细胞的功能.肝细胞移植后是否驻留、分化等有待于进一步探讨与研究.参考文献:[1]ANSBORO S，GREISER U，BARRY F，et al.Strategies for improved targeting of therapeutic cells:implications for tissue repair[J].Eur Cell Mater，2012，23：310-318.[2]STREETZ K L.Liver cell transplantation models for experimental clinical research:Prometheus in a different light[J].Dtsch Med Wochenschr，2013，138(16)：852-854.[3]MEIER R P，MÜLLER Y D，MOREL P，et al.Transplantation of mesenchymal stem cells for the treatment of liver diseases，is there enough evidence[J].Stem Cell Res，2013，11(3)：1348-1364.[4]YU Y，FISHER J E，LILLEGARD J B，et al.Cell therapies for liver diseases[J].Liver Transpl，2012，18(1)：9-21.[5]FAUSTO N，CAMPBELL J S，RIEHLE K J.Liver regeneration[J].Hepatology，2006，43(2 suppl 1):45-53.[6]RIEHLE K J，DAN Y Y，CAMPBELL J S，et al.New concepts in liver regeneration[J].J Gastroenterol 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游离供体门静脉完毕（结扎幽门静脉、脾静脉）
紧贴膈环下方剪断供体肝上腔静脉
分离切断供体门静脉幽门支
供体修整，肝下腔静脉及门静脉袖套
肝上腔静脉修整完毕，两角缝吊牵引线
游离受体肝下腔静脉
结扎切断受体胆总管 (已结扎）及分离肝固有动脉
分离门静脉左右支（图为左支）
经门静脉驱除受体肝脏余血（变为土黄色）
大鼠肝移植过程图
游离肝周韧带，显露结扎左膈下静脉
剪开胃结肠韧带无血管区，游离肝脏尾状叶
游离尾状叶
游离右腰静脉全身肝素化
分离结扎右肾离结扎右肾上腺血管
供体胆道置入硬膜外导管
经腹腔动脉全身灌注冰乳酸林格液
供肝灌注良好，变为土黄生色
供体植入，缝合肝上腔静脉前壁
肝上腔静脉吻合完毕前排除气泡
门静脉袖套吻合完毕后固定
门静脉袖套吻合开放供肝迅速再灌注
肝下腔静脉袖套吻合完毕
修整受体胆总管 (供肝胆道支撑管内已有胆汁产生）
两袖套及胆道插管完毕
关腹时大鼠清醒抬头
术毕大鼠自行翻身 ,毛发蓬松，直立。
游离肝周韧带，显露结扎左膈下静脉