影响糖化血红蛋白测定的因素及实验室检测注意事项

影响糖化血红蛋白测定的因素及实验室检测注意事项（张秀明，中山大学附属中山市人民医院检验医学中心主任）糖化血红蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是评价糖尿病血糖控制水平的首选指标，并且与糖尿病慢性并发症的发生和发展密切相关。

近年来，许多国家糖尿病学会和WHO推荐将其作为糖尿病的首选诊断标准，拓宽了HbA1c的应用范围。

然而在某些特定的情况下，尤其是当病人有血红蛋白变异体存在时常导致HbA1c测定结果的极度异常或与血糖水平不一致，甚至误导临床；而且多种因素可致HbA1c出现假性升高或降低，不能准确反映糖尿病病人血糖控制状况，影响临床诊断和治疗。

本文简要讨论糖化血红蛋白的生物化学特性，重点介绍糖化血红蛋白的测定方法、血红蛋白变异体对HbA1c测定的干扰，以及引起HbA1c 假性升高或降低的因素，并提出实验室检测注意事项。

一、HbA1c的生物化学：成人血红蛋白（hemoglobin，Hb）通常由HbA（97％）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）组成。

在健康人，几乎94%的HbA是非糖化的血红蛋白即HbA0，而6%的是糖化血红蛋白（glycated hemoglobin,GHb）即HbA1。

HbA1又包括HbA1a、HbA1b 和HbA1c，前二者含量较少约占GHb的1%，HbA1c是主要的糖化血红蛋白，约占GHb的5%。

HbA1a又由HbA1a1和HbA1a2组成，两者分别是血红蛋白β链N-末端与1，6-二磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖发生糖基化作用的产物，HbA1b是血红蛋白β链N-末端与丙酮酸的结合物，HbA1c由葡萄糖与血红蛋白β链N-末端的缬氨酸残基缩合而成。

HbA1c的形成主要依赖血糖浓度和红细胞寿命。

全部过程经历两个非酶促反应：第一步是快速反应期，葡萄糖粘附在血红蛋白N-末端的缬氨酸残基上，形成一个不稳定的醛亚胺中间产物即Schiffs碱；第二步是Schiffs碱经历漫长的葡糖胺（Amadori）重排反应形成稳定的酮胺化合物即HbA1c；或逆向转变成葡萄糖和血红蛋白。

由此可以看出，HbA1c与血液中葡萄糖浓度密切相关，因红细胞的平均寿命是120d，理论上HbA1c可反映过去120d血糖的平均水平，但在红细胞120d寿命中，近期血糖水平对HbA1c的检测值贡献更大，标本采集前30d的影响达50%，而采前集第31～90d的影响为40%，而91～120d的影响仅为10%，因此，HbA1c检测主要反映过去2～3月的平均血糖水平。

红细胞寿命受基因学、血液学和相关疾病等因素的影响，当解释临床结果时必须考虑这些因素，特别是能改变红细胞生成和红细胞结构的因素，临床医生应知晓这些因素可能导致HbA1c假性升高或降低。

二、HbA1c的测定方法：目前，市场上供实验室选用的测定HbA1c 的方法至少有3 0 余种，主要分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，目前常用的有离子交换层析法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构差异，这一类包括免疫测定法（immunoassays，IA）、酶法（Enzymatic assays，EA）和亲和层析法（affinitychromatography，AC）。

不同方法采用的原理不同，所测组分不同，但均可以按照国际临床化学和检验医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的参考测量程序进行标化。

（一）基于电荷差异的测定方法——1.阳离子交换HPLC法：是国内外最常用的分析方法，以Bio-Rad和TOSOH等厂商生产的糖化血红蛋白分析系统为代表。

其基本原理是：糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，对阳离子交换树脂（带负电荷）的吸附能力不同，选择洗脱缓冲液的离子强度与pH，不同组分的血红蛋白HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、HbA0和HbA2依次被洗脱，得到血红蛋白各组分的层析图谱。

样本中HbA1c 的浓度可用下式计算：GHb（HbA1c）% =GHb（HbA1c）/ΣHbA，ΣHbA包括糖化的和未糖化的HbA各组分。

HPLC法最突出的优点是具有优良的精密度，而主要缺点是易受血红蛋白变异体的干扰导致HbA1c假性升高或降低。

2.CE法：这是近年来发展起来的一种新技术，以法国Sebia公司的CAPILLARY 2 FP毛细管电泳仪为代表，其基本原理是：不同蛋白质分子在特定pH值缓冲液中所带电荷不同，通过高电压，在电渗流和电场力作用下的泳动速率也不同，从而使糖化和非糖化血红蛋白得以完全分离，从阴极到阳极依次为HbA2/HbC、HbES/HbD、HbF、HbA0、其他血红蛋白（包括少量HbA2）和HbA1c，按下式计算出HbA1c含量：HbA1c（%）=HbA1c/（HbA1c+HbA0）。

该法具有良好的精密度和正确度，不受常见血红蛋白变异体的干扰，而且可以用毛细血管血进行测定。

（二）基于结构差异的测定方法——1.IA法：包括免疫比浊法和胶乳凝集抑制法。

该法利用抗原抗体的特异性结合反应测定GHb，以Hbβ链糖基末端最初的3～5个氨基酸残基作为抗体识别位点，制备相应的单克隆抗体。

免疫测定法的优势是可在普通的生化分析仪上完成，快速简便，易于批量检测，临床应用广泛。

其主要缺点是不精密度相对较大，常见血红蛋白变异体可影响检测结果。

2.EA法：样本溶血后在蛋白酶的作用下释放出糖化缬氨酸，同时通过测定Hb的吸光度，求出血红蛋白浓度。

糖化缬氨酸在果糖缬氨酸氧化酶的作用下生成过氧化氢，后者在辣根过氧化物酶催化下与色素原反应产生颜色变化，颜色的深浅与HbA1c浓度成正比。

此法适用于各种自动化分析仪。

2014年，雅培公司使用果糖基二肽氧化酶在Architect生化分析仪上建立了一种新的HbA1c酶测定法，该法批内和日间CV均小于1.2%，线性范围达19mmol/mol(3.9%)～163mmol/mol(17.1%)，与HPLC法有很好的相关性，结果与IFCC法一致，氨基甲酰血红蛋白、甘油三酯和胆红素等不干扰测定。

3.AC法：该方法测定的是总GHb，包括HbA1c和酮胺结构。

凝胶柱中的琼脂糖被羰基二咪唑激活后与间氨基苯硼酸相连，而硼酸可与整合在Hb上的顺位二醇作可逆性结合，因此GHb与亲和树脂结合，再用反式多元醇配体-山梨醇洗脱，通过检测415nm波长处的吸光度值来量化糖化和非糖化成分。

该法不受血红蛋白变异体、HbF和氨基甲酰血红蛋白的干扰，对于血红蛋白变异体携带者长期以来一直被当作参考方法。

John等对基于HPLC硼酸盐亲和层析原理的Trinity Biotech Premier Hb9210糖化血红蛋白分析仪的分析性能进行了多中心评价，参加的实验室多数为IFCC和NGSP参考实验室网络成员，以SI单位表示时，HbA1c低、中、高值的变异系数CV分别为2.71%、2.32% 和2.14%，若以NGSP单位表示则分别为1.62%、1.59% 和1.68%，均明显低于IFCC推荐的上限3%和NGSP的上限2%，具有较宽的分析测量范围，与目前常用的HbA1c测定方法以及IFCC参考方法之间均具有很好的相关性，常见的血红蛋白变异体HbC、HbS、HbE和HbD不干扰测定。

（三）POCT测定法——在过去的几年中广泛使用POCT的方法测定HbA1c，POCT法主要基于亲和层析分离或免疫测定法的原理。

POCT的优点在于可在操作者办公室手指采血并且能够给病人和操作者迅速反馈结果及时调整治疗方案，主要缺点是重复性差，与参考方法的偏差较大，不同批号的结果一致性差，而且基于免疫学原理的POCT法受血红蛋白变异体的干扰。

总之，POCT 的质量目前尚难保证，其检测性能不足以满足临床需求。

使用POCT的操作者应确保其检测结果与NGSP认证实验室有可比性。

（四）测定方法的标准化——HbA1c 检测方法众多，结果差异较大。

为了解决HbA1c 检测结果的溯源性和可比性，美国（National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP）于1996年开始致力于GHb 的标准化研究工作，要求全美临床实验室的检测结果均应溯源至美国糖尿病控制和并发症临床试验（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）和英国糖尿病前瞻性研究（the United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）的研究结果上，指定在DCCT和UKPDS研究中所使用的Bio-Rex 70树脂HPLC法为参考方法。

通过NGSP认证的实验室，HbA1c水平至少有0.5%的变化被认为是具有统计学和临床意义。

目前，美国绝大多数实验室的检测结果均可溯源至DCCT，实现了HbA1c检测结果具有可比性的目标。

与此同时，1995年，IFCC成立了一个工作组致力于糖化血红蛋白标准化的研究工作，首先完成了HbA1c的定义，然后基于新的定义研制了校准品，并建立了参考方法，这种新方法已经被包括欧洲、美国、日本、中国在内的10余家IFCC国际参考实验室验证。

NGSP 的HbA1c测定结果以百分数报告，而IFCC结果使用国际单位（International System of Units，SI）报告，即以mmol A1c/molHbA来表示。

NGSP和IFCC的值呈线性关系，使用主回归方程两个系统的值可以相互转换。

ADA、欧洲糖尿病研究会（EASD）和国际糖尿病联盟（IDF）等发表了一致性声明，要求同时使用NGSP（%）和IFCC（SI）单位报告结果。

IFCC的新定义是：人体血液中的葡萄糖与血红蛋白β链N-末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定的已糖化合物，全称为血红蛋白β链-N-1-脱氧果糖-血红蛋白。

新的定义排除了葡萄糖与血红蛋白β链赖氨酸残基以及与血红蛋白α链任一氨基酸的结合物。

而通常所说的GHb 是指一个或更多个糖分子不可逆地结合在血红蛋白任一蛋白链的任一氨基酸上，包括HbA1c。

IFCC参考方法包括与内蛋白酶Glu-C共孵育、清除β链氮端的六肽、用质谱法或毛细管电泳法分离、定量糖基化以及非糖基化的六肽。

参考物质为人血液中提取的纯化HbA1c和HbA0混合物。

三、血红蛋白变异体对HbA1c测定的干扰（一）常见的血红蛋白变异体——迄今发现最为常见的血红蛋白变异体是HbS、HbE、HbC和HbD，全球范围的分布规律为HbS＞HbE＞HbC＞HbD，这四种变异体均由血红蛋白β链一个氨基酸被替换而生成。