(仅供参考)Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
illumina双端测序原理
illumina双端测序原理摘要：1.引言2.Illumina 双端测序原理简介3.测序过程4.数据分析5.应用领域6.总结正文：Illumina 双端测序是一种广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术。
该技术以其高度精确性和出色的数据质量而受到科研工作者的青睐。
本文将详细介绍Illumina 双端测序的原理、过程以及应用领域。
1.引言Illumina 双端测序是一种基于高通量测序平台的方法，可以同时对两个末端进行测序，从而提高测序数据的量级。
这种技术已经成为基因组学、转录组学和表观遗传学研究的重要手段。
2.Illumina 双端测序原理简介Illumina 双端测序采用了一种称为“桥式PCR”的技术。
首先，将待测样本进行随机打断，生成一定长度的DNA 片段。
然后，在每个DNA 片段的两端加上特定序列的接头，形成“桥接”结构。
接下来，通过PCR 扩增得到足够数量的“桥接”DNA 分子，最后进行测序。
3.测序过程测序过程主要分为三个步骤：样本制备、文库构建和测序。
样本制备包括DNA 提取、片段化、接头连接等步骤。
文库构建则是将片段化的DNA 片段与特定的接头连接起来，形成测序文库。
测序则采用Illumina 测序平台进行，通过测序仪器对文库中的DNA 片段进行测序，得到测序数据。
4.数据分析Illumina 双端测序的数据分析主要包括原始数据质量控制、比对、定量以及变异检测等。
通过这些分析，研究者可以获得目标序列的信息，如基因表达水平、基因变异等。
5.应用领域Illumina 双端测序技术在基因组学、转录组学和表观遗传学等领域有广泛应用。
例如，在全基因组关联分析中，该技术可以用于寻找与疾病相关的基因变异；在转录组学研究中，可以研究基因的表达水平和调控机制；在表观遗传学研究中，可以检测DNA 甲基化等表观遗传标记。
6.总结Illumina 双端测序技术凭借其高度精确性和出色的数据质量，已经成为基因组学研究的重要手段。
illuma测序原理(一)
illuma测序原理(一)Illumina测序1. 简介Illumina测序（Illumina Sequencing）是一种高通量测序技术，通常用于获取DNA或RNA样本的序列信息。
该技术采用Illumina公司的测序平台，具有高灵敏度、高标准化和高通量等特点，被广泛应用于基因组学、转录组学和表观基因组学等领域。
2. 工作原理Illumina测序的工作原理可以简要概括为：1.DNA建库：将待测样本中的DNA片段通过特定的方法进行文库构建，包括DNA片段的断裂、末端修复、连接接头添加等步骤。
2.簇生成：将文库DNA片段连接到微孔表面上的引物序列上，形成DNA片段簇，每个簇包含数百万个相同的DNA片段。
3.桥式扩增：通过PCR反应，使每个DNA片段形成桥状结构，并与其他DNA片段连接在一起。
这个过程在适当的条件下反复进行。
4.测序反应：引物和荧光标记的核酸碱基（dNTPs）在图案化和停止扩增的条件下进行反应，读取每一个DNA片段的碱基序列。
5.重复循环：以上步骤循环进行，每个循环会读取一个碱基，并记录下来。
6.数据分析：基于每个簇的测序结果，对测序数据进行分析和拼接，得到原始的DNA或RNA序列。
3. Illumina测序的特点•高灵敏度：Illumina测序技术能够检测到非常低浓度的DNA或RNA样本，适用于稀有序列的研究。
•高标准化：Illumina测序具有较低的错误率，并且可以高通量地测序多个样本，结果可靠且具有可重复性。
•高通量：通过Illumina平台，可以同时测序数百万个DNA片段，在较短的时间内获取大量的测序数据。
•可扩展性：Illumina测序技术可以根据研究需求进行灵活的扩展，从几百bp到数百bp的测序长度都可以满足。
4. 应用领域Illumina测序技术在众多研究领域中得到了广泛的应用，包括但不限于：•基因组学研究：用于鉴定基因组中的突变、SV（结构变异）和其他遗传变异。
•转录组学研究：用于确定细胞或组织中的RNA转录本，揭示基因表达的变化和调控机制。
华大二代测序原理
华大二代测序原理
华大二代测序（Illumina sequencing）是一种高通量测序技术，也称为高通量测序或短读长测序，是当前最常用的测序方法之一。
其原理基于桥式扩增和碱基荧光信号转换。
具体原理如下：
1. 文库构建：将DNA样品经过酶切或随机剪切形成大量短小的DNA片段。
然后将片段的两端进行连接，形成能够在单个DNA片段上进行扩增和测序的文库。
2. 桥式扩增：将文库中的DNA片段固定在一块玻璃芯片上，然后在其表面进行多次循环PCR扩增。
每轮循环PCR，每个DNA片段都会通过桥式扩增形成成百上千个相同的复制体，因此数目庞大的DNA复制体可在一块芯片上形成成百上千个簇。
3. 碱基荧光标记：在每次PCR扩增之后，加入由四种荧光标记色阵列的碱基（A、C、G、T）以标记进行扩增。
每种标记色阵列与不同碱基配对。
例如，红色标记色阵列代表碱基A，绿色标记色阵列代表碱基C，类似地，黑色标记色阵列代表碱基G，黄色标记色阵列代表碱基T。
4. 去除终止子：在每个周期结束后灭活不必要的核苷酸，然后进行清洁并准备下一个周期。
这个过程可以保证只在当前周期内加入了一种四种碱基的其中一种。
5. 信号检测和图像分析：每个碎片都会在单个碱基位点停顿，因
此在所有碱基位点上的荧光被摄像头记录下来，并分析荧光重叠模式，以确定该位点的碱基。
6. 数据分析：将图像转换为质量草图，并生成碱基对应于原始参
考序列的序列数据文件。
最后，将这些数据与某个基因组的参考序列
进行比对。
因此，通过华大二代测序，可以通过高通量、高速度的方式有效
地得到大量的DNA序列信息。
illumina测序原理
illumina测序原理
Illumina测序原理是一种高通量测序技术，它通过将DNA分子切割成小段，并使用DNA聚合酶与引物使其复制，最后通过测序仪读取DNA的碱基序列信息。
这种测序技术以其高度准确性和高通量特性而闻名。
Illumina测序过程基于桥式扩增的技术，首先将待测的DNA 分子随机切割成称为文库的小片段。
然后，这些DNA片段会与适配体（adapter）相连，适配体上含有特定序列的引物。
引物具有与DNA片段相互互补的序列，可以与DNA片段的末端结合。
接下来，这些连接好的DNA片段会被附着到玻璃芯片上的千余万片段连接“桥”的位置。
通过引物的作用，DNA片段与芯片上的DNA密切相连，形成以桥为中心的DNA聚集体。
这个过程被称为桥式扩增，同时也是Illumina测序技术的关键步骤。
在桥式扩增完成之后，双链DNA会被解旋成两条单链，之后使用DNA聚合酶和碱基以及荧光标记的核苷酸作为底物进行扩增。
聚合酶会根据DNA模板选择相应的碱基，并将其与底物结合形成新的DNA链。
当荧光标记的核苷酸被加入时，会释放出荧光信号，这个信号会通过摄像机被探测到。
在测序过程中，每次加入的碱基都会进行检测和记录。
通过重复这个过程，每个DNA片段的碱基序列将会被测定。
当测序完成后，可以通过计算机软件分析这些测定的碱基序列，获得
DNA样本的整体序列。
总的来说，Illumina测序原理基于桥式扩增技术，通过测序仪读取每个DNA片段的碱基序列信息，从而实现高通量、高精度的测序。
这种技术被广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究和应用。
Illumina 测序的原理和应用
1. Single DNA libraries are hybridized to primer lawn and extended by polymerase
6
2. Double-stranded molecule is denatured and original template is washed away
在Illumina的测序过程中，无论是单 端测序还是双端测序，都会用到特异 选择性链切断的过程。其中单端测序 的要切断1次，双端测序中的两条链 要先后各切断1次（共2次）。
单端测序：高碘酸希夫反应 。
双端测序： Illumina巧妙地利用了 “甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）”对 “8-氧鸟嘌吟糖苷（8-oxo-G）”的 选择性切断作用。
16
13. Sequenced strand is stripped off and the index primer is added for to seq index
3‘端
Index primer
17
5‘端
14. Repeat bridge amplification to form reverse strand after index sequencing 15. Sequencing the reverse strands
9
7. Multiple bridges are formed 8. dsDNA bridges are denatured and reverse strands are cleaved
10
9. Cleaved reverse strands are washed away and leaving a cluster with forward strands only
Illumina 测序的原理和应用
18
高通量测序的应用
DNA水平 RNA水平
19
2021/6/20
基因组denovo、重测序 外显子捕获测序 DNA甲基化测序 Chip-Seq 16s、宏基因组
转录组测序 数字表达谱DGE Small RNA lncRNA
19
高通量测序的应用
DNA
Chip-seq
甲基化
RNA
真核 原核
无参 有参
在Illumina的测序过程中，无论是单 端测序还是双端测序，都会用到特异 选择性链切断的过程。其中单端测序 的要切断1次，双端测序中的两条链 要先后各切断1次（共2次）。
单端测序：高碘酸希夫反应 。
双端测序： Illumina巧妙地利用了 “甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）”对 “8-氧鸟嘌吟糖苷（8-oxo-G）”的 选择性切断作用。
4
2021/6/20
4
什么是 flow cell？
Flow cell 即流动槽，如载玻片大小，有8个通道 即8条lane。
5
2021/6/20
5
1. Single DNA libraries are hybridized to primer lawn and extended by polymerase
接头：与flow cell结合区 Read1和Read2测序引物结合区
Index 用来区分不同样本
3
2021/6/20
3
Illumina测序流程
eneration 簇生成
序
流
程
Sequencing
测序
Data Analysis 数据分析
11
2021/6/20
11
Illumina测序流程
Illumina 测序的原理和应用.ppt
3
Illumina测序流程
eneration 簇生成
序
流
程
Sequencing
测序
Data Analysis 数据分析
4
什么是 flow cell？
Flow cell 即流动槽，如载玻片大小，有8个通道 即8条lane。
7
3. New synthesized strand is covalently attached to flow cell surface to form a bridge and extended by polymerase
4. Double-strand bridge is formed
8
5. Double-strand bridge is denatured and form two copies of covalently bound single-stranded templates 6. Bridge amplification cycle repeat
Protei n
20
Long ncRNA
转录组
DGE
sRNA
Thank you!
21
9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。 2020/11/72020/11/7Saturday, November 07, 2020 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。2020/11/72020/11/72020/11/711/7/2020 4:14:00 PM 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。2020/11/72020/11/72020/11/7Nov-207-Nov-20 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。2020/11/72020/11/72020/11/7Saturday, November 07, 2020 13、志不立，天下无可成之事。2020/11/72020/11/72020/11/72020/11/711/7/2020 • 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本
真核生物
总RNA
原核生物
利用Oligo (dT)富 集mRNA
去除 rRNA
将mRNA 随机打断成 ~200 nt
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCamples
cBot HiSeq2500
MiSe液相杂交
• 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。
Exon测序
特点
• 优点：
• 不足：
• 1、 与全基因组测序相比，外 显 • 1、与全基因组测序相比，不能
子测序具有测序覆盖度更深、 数 检测到基因组内较大的结构性
4种 Fl-NTP’s +
聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
形成的 桥
Paired End Turnround
形成的双 链的桥
Paired End Turnround
等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链
模板链
Paired End Turnround
线性化，3’ -OH阻断 杂交Read2测序引物
HiSeq SBS 测序流程
1
3
Paired End Turnaround
2
Sequencing By Synthesis，SBS测序原理
4种 Fl-NTP’s + 聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
3’ -OH阻 断
Read2测序引 物
新合成的 链
Sequencing By Synthesis 2nd Read
4种 Fl-NTP’s + 聚 合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
CASAVA BaseSpace
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
DNA
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
HiSeq SBS 测序流程
进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序
丢弃原始模板链
新合成的链
桥式PCR扩增
单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥” 以接头为引物进行扩增
桥式PCR扩增
变性
变性双链的“桥” 得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子
第二轮桥式PCR扩增
完成桥式PCR扩增
完成28循环的桥式PCR
线性化
双链“桥”变性为单链 红色箭头为P5接头上的 切割位点
模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上
第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程化
切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链
阻断
阻断3’ –OH
杂交Read 1 引物将测序引物杂交到的接头上Read1 测序引 物
Illumina 测序流程构建(~ 6 hrs)1-8 samples 1-8 samples
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiS 3’加ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCLangos,P7 和P5接头)
仪器简介
单条DNA 模板
35个循环的桥式PCR
约1000条 DNA模板的 拷贝
cBot
HiSeq Sequencer单链
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA amples 1-8 samples
DNA
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
1-8 samples 1-8 samples
cBot HiSeq2500
MiSeq
HiSeq2000 HiSeq2500
GA IIx MiSeq
HCS/RTA ICS MSR
CASAVA BaseSpace
测序芯片 (Flow Cell)简介
在flow cell上进行cluster簇生成
flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链
含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面
接头序列 5’-3’ 延伸
双链DNA变性
模板链被冲洗走 新合成的链留在FlowCell
上
原始模板链
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
Clusters
100 Microns
Paired End TurnroundLeabharlann 变性掉已完成测序合成的 片段
恢复被阻断的3’ –OH
Blocked 3’-ends
已完成测序合成的片段
Paired End Turnround
桥式PCR 5’-3’延伸