SSR分析的原理及操作技术报告

以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术： 单核苷酸多态性（SNP）
SSR简介
在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，
根据重复序列在基因组中的分布形式可分为： 串联重复序列（Tandemly repeated sequences） 分散重复序列（Interspersed repeated sequences） 依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联 重复序列分为： 卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp；
和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引 物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。
SSR标记的基本原理
由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩
增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态 性称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的 一对等位基因。
0.1％硝酸银400ml
ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四硼 酸钠定容至500ml
漂洗
ddH2O
8.观察 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：
将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好
的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳 子，静置1h，让其聚合凝固。
5％变性胶 尿素 （Urea） 5×TBE buffer 40％丙稀酰胺 10％过硫酸铵 TEMED 40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide） 甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide） 100ml 42g 20ml 12.5ml 400µl 87.5µl 100ml 38g 2g
用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中 的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受
其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条 DNA的迁移率可
相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段和检 测蛋白质－DNA复合物。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通 常PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离效果优 于非变性胶。因为杂合个体在PCR后期的循环中 会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产 生了3条带甚至是4条带，而不是正常的2条带。这 种情况出现会干扰等位基因的统计。
特点二：能够指导特定DNA片段的合成。
如何实现？
PCR反应体系
一对特异引物： 1.引物长度：典型的引物长度为18-24bp，引物需要足够长，保证序列 独特性。但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性。较长的 序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢
，从而降低了产量；
是一类由几个核苷酸（多为2～4个）为基本单位多次串联重复而
形成的DNA片段，其长度一般较短，多在200bp以内。
微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物 基
因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但 （AT管微卫星DNA分布于整个基因组中的不同位置，但某 一特定的微卫星的两端侧翼序列通常都是保守性较强的 单一序列，将重复序列及其两侧的DNA片段进行克隆
载样缓冲液（loading buffer）
指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400等组成载 样缓冲液，加入到扩增好的PCR产物当中。
作用： 1.增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。
2.形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。
3.使样品呈色，使加样操作更方便。
6.电泳：每个点样孔中，点加适量的混合物（4µL），每排梳孔中最左
边的梳孔用于点加DNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量， 以300V电压进行恒压电泳，电泳液为0.5×TBE，待溴酚蓝条带泳动至 胶板底端时停止电泳。
7.染色
步骤 漂洗30s ddH2O 试剂
染色8min
漂洗30s 显色4min
实验方法与步骤
1.实验材料
马贵荔（母本）×焦核三月红（父本）F1杂种群体中部分个 体的基因组DNA溶液。每人做4个模板。
一对特异引物： B-F09 F：5’TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3’ B-F09 R：5’CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3’
2.配制SSR扩增的反应液：
PCR条件优化
优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设
计引物。 热启动技术：在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超 过模板Tm值（80℃）后，再加入关键试剂如Taq DNA聚 合酶等。这样操作可以减少非特异性扩增。
创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如降低Mg2＋，
dNTP浓度，优化pH及减少Taq酶的用量，减少循环中各 部分的时间或循环数，提高退火温度等。
各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应时，可将所用的的相同组份 一次取样、混匀后再分装至各个反应中。
组分 ddH2O 10×buffer缓冲液 1个反应体积 10.2µL 2.0µL 1.6µL 1.0µL 1.0µL 4µL 0.2µL 20µL 1× 0.2mM 0.25µM 0.25µM 1ng/µL 1U 0.8µL 80µL 终浓度 4个反应体积 40.8µL 8µL 6.4µL 4µL 4µL
成三维带状网络结构的凝胶。
这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂 的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶
变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核 酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁移 率几乎与其碱基组成及序列完全无关。
非变性聚丙烯酰胺凝胶
小卫星DNA：基序长10～60bp；
微卫星DNA：基序长1～6bp，其功能：重组热点、对基因的调节和表达以 及性别决定等。
SSR简介
微卫星DNA即简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），
或者微卫星序列（microsatellite，MS）， 又称短串联重复（short tandem repeats，STR），
型，所以其电泳迁移率较快。
电泳介质
琼脂糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
优点：
① 分辨率极高，可分开长度仅相差0.1％的DNA分子，即 1000bp中相差1bp； ②从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用于要求 最高的实验。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂 TEMED(N,N,N,N’一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下， 聚合形成线状长链，在交联剂如N,N-甲叉双丙烯酰胺参与 下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形
（含15mM
Mg＋）
2.5mM dNTP 5µM 引物F 5µM 引物R 模板DNA（5ng/µL） Taq酶（5U/µL） 总体积
3.SSR-PCR
配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为： 94℃ 3min（预变性）；
94℃ 50s→55℃ 50s→72℃50s（35个循环）；
72℃ 10min（延伸反应）
染色方法与原理
溴化乙锭（EB）染色法：但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭
的荧光有猝灭作用，EB染色法很难检测到少于10ng的DNA条带。
银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。
优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可
永久保存
原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后用 还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA电泳带 染色成黑褐色
2.引物浓度：一般0.1-0.5 mol/L，过高的引物浓度会加剧错配发生， 特异性下降；
3.合理的G/C含量：一般为40％～60％。
PCR反应体系
Mg2＋溶液 ：其浓度直接影响引物退火的特异性、产物特异性以及酶的 催化能力和准确性等，适当降低Mg2＋浓度可增加特异性。 模板DNA：一般1ng/1µL，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 ； dNTP ：常用浓度为50-200mol/L，种dNTP浓度应相等，浓度过高
易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。
Taq酶 ：DNA聚合酶，热稳定，最适温度72 ℃，酶量增加使反应特异 性下降;酶量过少影响反应产量。
10×buffer缓冲液（不含Mg2＋ ）：维持PCR pH的稳定。
PCR循环条件
高温变性：双链DNA模板加热变性成单链； 低温退火：在低温下引物与单链DNA互补配对； 退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特 异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为20bp，GC 含量为50％的核苷酸的典型引物，55 ℃是比较适宜的退火温度。 适温延伸：在适宜温度下Taq DNA酶催化引物沿着模板DNA延伸。
电泳原理
在生理条件下，核酸分子之糖－磷酸骨架中的磷酸基团， 是呈离子化状态的。当核酸分子被放置在电场中时，他们 就会向正电极的方向迁移。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳
的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较
小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构
5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8µL的loading buffer混合，得到 混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。
Loadingbuffer组分 98％Formamide（甲酰胺） 10MmEDTA（pH8.0） 0.25％Bromophenol Blue（溴酚蓝） 用量 49ml（100％） 1ml（0.5M，pH8.0） 0.125g