小鼠灌注取脑
灌流取脑
大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。
2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。
3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。
小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。
4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。
5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。
时,剪开右心耳,使血液排出。
观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。
固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。
7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。
取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。
8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。
首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。
可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。
小鼠缺血再灌注
小鼠缺血再灌注（实用版）目录1.小鼠缺血再灌注的背景和意义2.小鼠缺血再灌注的实验方法和操作步骤3.小鼠缺血再灌注的实验结果和分析4.小鼠缺血再灌注的结论和展望正文一、小鼠缺血再灌注的背景和意义小鼠缺血再灌注是指在小鼠体内某一部位发生缺血后，再通过灌注使其恢复血流。
这一过程在生物医学研究中具有重要意义，因为它可以模拟人类某些疾病的发生过程，如心肌梗死、脑卒中等。
通过研究小鼠缺血再灌注，可以深入了解缺血后再灌注对组织和器官的影响，为临床治疗提供理论依据。
二、小鼠缺血再灌注的实验方法和操作步骤1.实验动物选择：选用健康成年小鼠，分为实验组和对照组。
2.制备缺血模型：将实验组小鼠放入灌注装置中，通过调整灌注流量和时间，使小鼠某一部位（如心肌、脑组织等）发生缺血。
3.观察缺血程度：通过检测相关生理指标（如心率、血压、血氧饱和度等），评估小鼠缺血程度。
4.再灌注操作：在观察到缺血程度达到预设值后，恢复灌注流量，使缺血部位重新获得血流。
5.观察再灌注效果：通过检测生理指标，评估再灌注对小鼠的影响。
三、小鼠缺血再灌注的实验结果和分析实验结果显示，在缺血发生后，小鼠的心率、血压、血氧饱和度等指标会发生明显变化。
再灌注后，这些指标会逐渐恢复到正常水平。
但不同缺血时间和程度的小鼠，再灌注后的恢复情况有所不同。
通过对实验结果的分析，可以得出以下结论：1.缺血再灌注对小鼠的组织和器官具有一定的保护作用，能够减轻缺血带来的损伤。
2.缺血时间和程度的不同，再灌注的效果有所差异，提示再灌注治疗需要个体化。
四、小鼠缺血再灌注的结论和展望总之，小鼠缺血再灌注实验为研究缺血后再灌注的生物学效应提供了一个有效模型。
通过对这一模型的深入研究，可以为临床治疗缺血性疾病提供理论依据和技术支持。
小鼠脑缺血再灌注损伤药理实验研究技术路线图
Western blot 检测
Bax 、 Bcl-2 、
CytC
、
Caspase-9 、
Caspase-3 、
PARP-1 蛋白表达
小鼠脑缺血ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ灌注损伤药理实验研究技术路线图
ICR 小 鼠 (雄 ) 性 ） (xuxing
空白对照 组：假 手术组
局灶性脑缺血损 伤模型组
模型+阳 性药物 （×××）组
模型+ ×× ×（ 高、 中、低剂量）组
连续给予受试药物 5天
线栓法复制大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性脑缺血损伤模型：缺血 2h，再灌注 24h（缺血前 1h 给药一次，再灌注后 12h 再给药一次） 依 Bederson 法进行神经功能缺陷评分
取缺血区脑组织检测
1、T TC 染色 法测 定 脑梗死 面积 2、干湿 重法 检测 脑 水肿程 度 3、 HE 染 色 法进 行组织病理 学观 察
1 、 分光 光 度法 检 测 Caspase-3 活性 2 、 原 位末 端 标 记 （TUNEL）法检测细 胞凋亡 3 、 免疫 荧 光法 测 定 Bax 、 Bcl-2 、 Caspase-3、Cyt C 阳 性细胞数目
小鼠缺血再灌注
小鼠缺血再灌注
小鼠缺血再灌注（I/R）是一种实验模型，用于研究组织缺血引起的损伤以及血液再灌注对损伤的影响。
这一模型通常用于心血管疾病、脑卒中、肝脏和肾脏等器官的研究。
操作步骤通常包括以下几个阶段：
1.缺血阶段：通过暂时封闭（结扎）或阻断（通过其他方法）血
管，以模拟组织缺血。
这可以在不同的器官中进行，比如通过
结扎冠状动脉来模拟心肌缺血，或者结扎肾动脉来模拟肾脏缺
血。
2.再灌注阶段：在一定时间后，重新开通或恢复血液供应，模拟
组织再灌注。
这一步骤旨在模拟血流的恢复，但在一些情况下，
再灌注本身也可能导致组织损伤。
3.取样和分析：小鼠通常在不同的时间点被处死，组织样本被取
出以进行各种生化、组织学和分子生物学分析，以评估缺血再
灌注对组织的影响。
小鼠缺血再灌注模型可以用于研究相关疾病的机制、开发治疗策略以及评估药物的疗效。
例如，这个模型可以用于研究心肌梗死、脑卒中、肾功能损伤等疾病。
在进行这种类型的实验时，需要确保符合伦理和动物福利的要求，并遵循实验室和国家的相关规定和指南。
研究人员应该采取适当的措施来减少动物的痛苦和苦恼。
取小鼠脑组织
取小鼠脑组织丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2. 步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。
具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。
然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。
用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。
生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。
然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。
取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。
小鼠灌注取脑
成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤
实验步骤：
1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。
用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。
灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。
整个PFA灌流时间约为5min。
（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。
将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。
取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。
将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。
需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。
2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。
3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。
4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。
5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。
此时可将脑取出进行冷冻切片。
老鼠灌注取脑
有无影响？
答：固定时间过长蛋白多肽链都交连在一起了,抗原性就很弱 了，很可能没有阳性结果,抗原修复时一般的修复很难把抗原性恢复. 可能会有影响，但不会太大。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。 4.灌注多长时间？灌注液多少？
看了很多经验，每个人的灌注液用量都不一样，灌注速度也能没 有很清楚的说法，灌注时间也不确定。我的总结为，还是看灌注成功 的标志。现将看到的比较详细的处理方法列出。灌注速度，大家比较 公认的是先快后慢。
灌注压过小,不利于灌注液在组织中的灌流,灌注压过大,会造成 毛细血管和器官组织的损害,不利于组织切片的观察。一般灌注生理 盐水时灌注压在 20 伏左右,快速灌流多聚甲醛时一般在 10 伏左右,待 大鼠四肢出现明显抽搐后,再缓慢灌流多聚甲醛 30 min,灌注压一般在 5 伏左右。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)： 流程： 1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片. 具体过程： 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴 露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰 冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液 澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛 XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固 定 24 小时。 Tips： 1.多聚甲醛的配置：
简便方法：先配好 PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱 密封放置 2 天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。 注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免 心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液 器备用。 3.10％水合氯醛按 4mL/100g 的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉， 用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧 顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定， 充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入 100~150mL， 至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变 白是排出血液的有效观察指标。 6.继续用 4%多聚甲醛灌流 250ml 固定。 7.后固定：灌流后的脑组织置于 4％PFA 置 4 度冰箱内进行后固定， 时间>2h，过夜最好。 补充： 还有一种省时省剂的方法。 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌 注生理盐水约 100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲 醛。多聚甲醛用 100ml 以下即可。 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明 腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。
电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2gp91phox表达的影响
电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2/gp91phox表达的影响曾超，陈静，刘文兵,李辉，王静,马睿杰(浙江中医药大学附属第三医院•浙江杭州310012)摘要目的:探讨电针对脑缺血再灌注(I/R)损伤后的神经保护机制，明确电针对脑损伤后氧化应激的抑制作用。
方法:采用小鼠大脑中动脉闭塞模型制备脑局灶性缺血1h再灌注3,24,48h模型。
每组又分为模型组、电针组、药物组、gp91phox基因敲除组(下文简称基因组)，另设同时段假手术组。
以神经功能缺损评分和局灶脑血流(rCBF)变化为造模成功和效应指标，并RT-PCR检测NOX2/gp91phox基因在小鼠脑组织的表达情况，光泽精增强发光法检测NOX活性。
结果:①神经行为学评分：造模各组均有不同程度的缺损表现，再灌注即刻缺损情况较再灌注干预后严重，基因组灌注即刻评分明显低于模型组(P<0.05)，与模型组比较,灌注后3、24、48h基因组、药物组、电针组神经行为学评分均明显降低(P<0.05)。
②rCBF：各造模组rCBF明显减少，灌注后3、24、48h各组rCBF均有增加，药物、电针组比模型组升高明显(P<0.05)。
③NOX活性:模型组各时相之间无明显差异，基因组NOX活性无明显表达(P<0.01),药物组、电针组比模型组的同时相均有明显下降(P<0.01),药物和电针组的组间比较无明显差异。
④NOX2/gp91phox基因表达:模型组各时相之间无明显差异，基因组无蛋白表达，与各组比较均有显著差异(P<0.01),药物组、电针组比模型组的同时相均有明显下降(P<0.01),药物组和电针组的组间比较无明显差异。
结论:通过与敲除gp91phox基因组的小鼠相比较，电针"百会""大椎"穴位可以通过抑制NOX2/gp91phox表达，达到抑制I/R后小鼠的氧化应激损伤效果，发挥保护脑组织的作用。
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成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤
实验步骤：
1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。
用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。
灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。
整个PFA灌流时间约为5min。
（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。
将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。
取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。
将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。
需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。
2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。
3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。
4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。
5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。
此时可将脑取出进行冷冻切片。