α-淀粉酶生产重要参数

α-淀粉酶发酵的生产工艺设计

摘要：

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。对α-淀粉酶性质及其应用进行了相关综述。

关键词：α-淀粉酶；生产工艺设计；性质；应用

Abstract：α-amylases are universally distributed throughout the animal，plant and microbial kingdoms．They can hydrolyse starch molecules to give diverse products including dextrins and progressively smaller polymers composed of glUcose units．α-amylases are one of the most popular and important form of industrial amylases．These enzymes are applied in baking industry，the processing of starch，ferm entation，brewing industry，textile and paper industries．The present review highlights the properties and applications ofα-Amylases．

Key words：α-amylase；properties；applications

1 绪论

1.1α-淀粉酶性质简述

1.1.1α-淀粉酶简述

α-淀粉酶广泛存在于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中[1]。米黄色、灰褐色粉末。能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶.也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[2]。作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH值范围5.5~7.0，最适pH值为6.0。Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。可催化水解α-1,4-糖苷键，但只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖[3]。主要

存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中[4]。

1.1.2 α-淀粉酶的结构

目前，已对很多不同种类和来源的α-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图[5]。研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku 左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的[6]。

1.1.3 底物特异性

α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同[7]，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等[8]。

1.1.4 最适pH和最适温度

反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。

通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH 为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围[9]。不同微生物来源的α-淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，

而最高的能达到100℃～130℃。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[10]。

1.1.5 金属离子

α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA 等对α-淀粉酶也有抑制作用[11]。

α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca2+对α-淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。结晶高峰淀粉酶A(TAA)包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对α-淀粉酶没有影响[12]。

1.1.6电场强度

实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象．姚占全等[12]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响[13]。第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.5～6.0kV／cm 范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%～26.2%之间。第1O天测定，酶活性变化幅度在0.2％～16.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失[14]。

2 工艺流程设计

2.1 生产方法的选择

(一)固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶

将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干[15]。

(二)深层发酵法生产α-淀粉酶

斜面菌种制法同前。将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时[16]。当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时[17]。

2.2.2α-淀粉酶培养基的制作

（1）培养基的类型

培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型[18]。

（2）孢子培养基孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异[19]。对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。α-淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。

（3）种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子[20]。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，

氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。α-淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

（4）发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。α-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵[21]。

2.2.3 种子扩大培养

本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：

孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐

1）孢子制备

将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

2）种子制备

将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

3）发酵罐培养

培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。

2.2.4 空气灭菌

此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等[21]。

1）过滤除菌流程

流程如下：采风塔→空气粗过滤器→空气压缩机→储气罐→冷却器→旋风分离器→冷却器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器。

2）无菌空气的检查

现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养法来检查[21]。具体方法如下：500ml三角瓶内装斜面培养基50m1，其组成为麦芽糖6％、豆粕水解液6％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO40. 4％、CaCl2 0.2％、NH4C1 0.15％，pH 6.5～7.0，接种后置旋转式摇床亡，(37±1)℃下培养28h左右备用。

2.2.5 发酵过程的工艺控制

1）发酵过程的补料策略

中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶的需要[22]。α-淀粉酶生产中要经常补料，用3倍年度浓度碳源的培养基补料，体积相当基础料的1/2，从培养12h开始，每小时1次，分30余次补加完毕。延长了发酵时间，提高了酶活力和单罐产量。

2）发酵过程pH值的控制

各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。培养基中C/N比值高，发酵液倾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，发酵液倾向于中性或碱性，pH偏高。α-淀粉酶最适pH为6.8～7.2。因此，在发酵过程中，可通过添加适量的尿素或碳酸钙等来调节pH上升或下降。

3）发酵过程温度的控制

温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质[23]。不同的菌种有着不同的最适温度。枯草杆菌发酵温度控制在35℃～37℃最适宜[24]。4）溶氧的控制

α-淀粉酶发酵是需氧发酵，无论是基质的氧化，菌体的生长还是产物的合成均需大量的氧气。若发酵液中氧气不足，可通过加大通气量，适当降低温度，提高罐压，补水，提高搅拌速度来控制。α-淀粉酶发酵过程中，0～12 h通气量为1：0.67 vvm，12 h至发酵结束通气量为1：（1.0～1.33）vvm 搅拌转速200r/min。罐压0.5kg/cm2。

5）染菌的控制

在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。

2.2.6 下游加工

下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。

下游加工过程的一般工艺流程为：

固体→细胞破碎→分离

发酵液→预处理→固液分离液体→初步纯化→高度纯化→成品加工

1）发酵液的过滤和预处理

预处理就是除去高价离子和蛋白质，对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它与钙离子生成的草酸钙，还能促使蛋白质沉淀，加磷酸既能降低钙离子也能降低镁离子。对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂，调节pH值或加热。过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。

2）提取

α-淀粉酶常用的提取方法有：盐析法、乙醇淀粉吸附法和喷雾干燥法，这里用盐析法。具体方法：发酵液经热处理，冷却到40℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。滤饼加2.5倍水洗涤，洗液同发酵液合并后，在45℃真空浓缩数倍后，加(NH4)2SO4 至40%饱和度。盐析沉淀物加硅藻土后过滤，滤饼于40℃烘干磨粉即成粗酶制品。由酶液到粉状制酶剂的收率为70%。

成品固体酶制剂的干燥方法有烘房、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥[25]。由于喷雾干燥生产能力大，维修保养简单，因此生产中常采用这种方法。

3）纯化

α-淀粉酶的纯化方法可采用凝胶过滤法，就是以特定的凝胶物质为分子筛装入层析柱，再通过分离溶液时大于凝胶孔径的分子会被排阻在胶粒外，因此它们将“绕道通过”；小于该孔径的分子，由于可以自由出入胶粒内外，因此将沿着胶粒缝隙而直接流出。通过一段程度的凝胶层析柱后，大小分子将依次先后流出[26]。

3.3 枯草芽孢杆菌生产发酵α-淀粉酶工艺总流程图

3工艺计算

3.1工艺技术指标

3.1.1发酵类型

3.1.1.1微生物的转化发酵

微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱梭反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。最古老的生物转化，就是利菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化和抗生素的生物转化等等。

3.1.1.2生物工程细胞的发酵

这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的"工程菌"[27]，细胞融合所得的"杂交"细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素酚化酶等，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。

3.1.2发酵的操作方式

根据操作方式的不同，发酵过程主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。

3.1.2.1分批发酵

营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，中间除了空气进人和尾气排出，与外部没有物料交换。分批发酵的具体操作如下：首先种于培养系统开始工作，即对种子罐用高压蒸汽进行空罐灭菌（空湖），之后投人培养基再通高压蒸汽进行实罐灭菌（实消），然后接种，即接人用摇瓶等预先培养好的种于，进行培养。在种子罐开始培养的同时，以同样程序进行主培养罐的准备工作。对于大型发酵罐，一般不在罐内对培养基灭菌，而是利用专门的灭菌装置对培养基进行连续灭菌（连消）[28]。

3.1.2.2连续发酵

所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期[29]。在稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、ｐＨ值等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。连续发酵使用的反应器可以是搅拌罐式反应器，也可以是管式反应器。在罐式反应器中，即使加人的物料中不含有菌体，只要反应器内含有一定量的菌体，在一定进料流量范围内，就可实现稳态操作。

3.1.2.3补料分批发酵

补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。补料在发酵过程中的应用，是发酵技术上个划时代的进步。补料技术本身也由少次多量、少量多次，逐步改为流加，近年又实现了流加补料的微机控制。

3.2 发酵工艺控制

3.2.1温度

温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响，如发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的溶解度和

传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。最适发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度，它随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据发酵的不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度，在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。

3.2.2ｐＨ值

PＨ值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：①影响酶的活性，当ｐＨ值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；②影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；③影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；④PＨ值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

3.2.3溶解氧浓度

对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好软件微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的。前者是指溶解氧浓度对生长或合成有一最适的浓度范围，后者一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。为了避免生物合成处在氧限制的条件下，需要考察每一发酵过程的临界氧浓度和最适氧浓度，并使其保持在最适氧浓度范围。现在已可采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。

4发酵过程的主要控制参数

4.1物理参数

（1）温度（℃）直接影响发酵过程的酶反应速率，氧的溶解度和传递速率，菌体生长速率和合成速率。（2）压力（Pa）影响发酵过程氧和CO2的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.2×105～0.5×105 Pa。（3）搅拌速度（r/min）搅拌器在发酵过程中的转动速度。其大小影响发酵过程氧的传递速率，

受醪液的流变学性质影响，还受发酵罐的容积限制（4）搅拌功率（kW）搅拌器搅拌时所消耗的功率（kW/m3），在发酵过程中的转动速度其大小与液相体积氧传递系数有关（5）空气流量（m3空气/（m3发酵液·min））单位时间内单位体积发酵液里通入空气的体积，一般控制在0.5～1.0（m3空气/（m3发酵液·min））（6）粘度（Pa·s）细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。（7）浊度（％）反映应单细胞生长情况（8）料液流量（L/min进料参数）

4.2 生物参数

（1）菌丝形态

菌丝形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一

（2）菌体浓度

菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。生产上，常常根据菌体浓度来决定补料量和供氧量，以保证生产达到预期水平根据菌体浓度研究菌体比生长率，基质比消耗率等动力学参数，以此确定最佳发酵工艺

5. α-淀粉酶的生产方法

5.1生产方法的选择

将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。

5.1.1深层发酵法生产α-淀粉酶

斜面菌种制法同前。将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶

活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。

6 育种

6.1 紫外线诱变育种：

取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

6.2 诱变方法以及变异菌株的筛选

①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量(μg/ml)，在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4 h。③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36 h。⑥用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。倒入200 mm ×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。然后把5 mm disc纸顺序放在培养基表面。⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。把disc 培养皿经37℃，24h分别培养。⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相对应的1 ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培养，接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌

株。经菌种诱变选育α-淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育α-淀粉酶高产菌株。

经NTG反复多次处理，α-淀粉酶活力有较大幅度提高。在经5次NTG处理之后，其变异株α-淀粉酶活达到34 200 (U/ml)，较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。

6.3 α-淀粉酶分离纯化：

α-淀粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法

6.3.1 α-淀粉酶的分离和纯化：

高纯度α－淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化α－淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度α－淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化的主要方法。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性α一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸α一淀粉酶，纯化倍数为11.7，活力回收率为29.8%。

6.3.2 实验方法

（1）反胶团系统的配置将适当比例的正丁醇和异辛烷加入比色管，摇匀。再加入适量CTAB，放入加热套中加热溶解，摇匀，使其均匀分布于有机相，得到澄清透明稳定的反胶团系统。

（2）前萃取将α-淀粉酶溶解于不同缓冲液中，稀释，并用4层洁净纱布滤清。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH(pI)，构成初始水相。将反胶团相和水相置于50 mL带塞三角烧瓶中，在振荡器上剧烈摇晃后(250 r/min, 10 min)，倾入离心管，进行离心(3 500 r/min, 5 min)，用滴管小心地将两相分开取上层有机相待用。（3）反萃取用去离子水配制适当pH值(pH

上剧烈摇晃后(250 r/min，10 min)，倾入离心管，进行离心(3500 r/min，5 min)。用滴管小心地将两相分开，下层水相即为纯化的淀粉酶。

6.3.2.1分析和测试方法

（1）α-淀粉酶活力的测定，采用国标QB/1803—93，对萃取前的粗酶以及萃取后的精制酶的酶活力进行测定，依据所附“吸光度和淀粉酶酶浓度对照表”。将吸光度换算为酶活浓度c，进而求出酶活D660。按下式计算：

D660=c×n

式中：c———测试酶液浓度，u/g；

n———样品的稀释倍数，g/mL。

平行试验相对误差不得超过2%。

（2）α-淀粉酶萃取率E：按下式计算：

E=反萃取水相中酶的总活力分相前加入的酶总活力×100%

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