基因组测序的原理与方法

基因组学是一个大学科
• “界门纲目科属种”，地球上现存物种近亿，所有生生灭
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灭的生物，无一例外，都有个基因组。 基因组作为信息载体，它所储存的信息是最基本的生物 学信息之一；既是生命本质研究的出发点之一，又是生 物信息的归宿。 基因组学研究包括对基因产物（转录子组和蛋白质组） 的系统生物学研究。 基因多态性的规模化研究就是基因组多态性的研究。 基因组学的研究必然要上升到细胞机制、分子机制和系 统生物学的水平。 基因组的起源与进化和物种的起源与进化一样是一个新 的科学领域。 基因组信息正在以天文数字计算，规模化地积累，它的 深入研究必将形成一个崭新的学科。
Whole Genome Shotgun
工作草稿（框架图）与完成图
Chromosome
“Working Draft” (90%; 4X)
Gap1 Gap2
Finished Genome (99.99%; 8X)
BAC by BAC
The sequence of the human genome C. Venter et al. Science 16 Feb. 291: 1304 – 1351, 2001
两种大规模基因组测序策略的比较
策 项 目
遗传背景 速度 费用 计算机性能 适用范围 代表测序物种
略 逐步克隆法
需要（需构建精确的 物理图谱） 慢 高 低（以BAC为单位进 行拼接） 精细图 人、线虫
全基因组霰弹法
不需要 快 低 高（以全基因组为单 位进行拼接） 工作框架图 果蝇、水稻
BAC by BAC
大规模基因组测序的 原理与方法
胡松年 husn@big.ac.cn
―基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础
人体解剖图奠定了现 代医学发展的基础
―基因组序列图”将奠定二十一世纪生 命科学研究和生物产业发展的基础！
生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之 中
… the sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project carried to completion by the methods described in this issue.
Maynard V. Olson , The maps: Clone by clone by clone , Nature 409, 816 - 818 (2001)
Regional mapping
Regional mapping
Regional mapping
Minimal tiling path selected for sequencing.
Beijing
Map
DM1-2b11s C .G TA HLC A 44a05 D3S1304 SG -82964 W D3S3591 sts-T58150 C I-1341
逐步克隆法（Clone by Clone)
物理图谱的构建
大片段克隆的筛选 霰弹法测序与“工作框架图”的构建 序列的全组装与“完成图”构建
物理图谱的制作
物理图谱的制作——序列标签位点（STS）作 图
物理图谱是以特异的DNA序列为标志所展示的染色体图。 标志之间的距离或图距以物理距离如碱基对（base pair；bp， Kb , Mb)表示。最精细的物理图是核苷酸顺序图，最粗略的物 理图是染色体组型图。 STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS （Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选择 出来的长度在200～300bp左右的特异性短序列（每个STS在基 因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每100Kb一 个），将DNA克隆片段有序地定位到基因组上。
BIGIS-1 BIGIS-4
9
大规模基因组测序的几个支撑技术

Sanger双脱氧末端终止法 PCR 技术 DNA 自动测序仪的发展 生物信息学分析软硬件设施
“双脱氧末端终止”的含 义
PCR（聚合酶链式反应）原理
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）
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测序设备的 垄断和高速度换代
Less Than 5 yrs
ABI3730xl ABI3130xl ABI3730 ABI3700xl 5500xl SOLiD 5500 SOLiD SOLiD3
ABI3700 ABI3130 ABI377 ABI373 Mb4500 Mb4000 Mb1000
在含有氯霉素 的固体培养基 中培养 电转化，将连接 产物导入大肠杆 菌感受态细胞
插有外源DNA片段的BAC载体
BAC克隆的筛选
每一个菌落为带有相同 外源DNA片段的单克隆
Contig
“STS-PCR反 应池”方案筛 选种子克隆
特定的STS标 记
相互间具有重叠片段的 BAC克隆根据STS信息组装 成contig，并定位于基因组上

大插入片段基因组文 库的构建（BAC文库）

以特定STS为标记筛 选并定位克隆

含有STS的克隆在基 因组中排序
关 于 文 库
文库的概念来自百度文库
含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体
宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，
常用的有大肠杆菌、酵母等
载体：能携带外源DNA进入宿主细胞
的工具，常用的载体有质粒载体、噬 菌体载体、细菌人工染色体等
基因组学的基础理论研究
基因组学是要揭示下述四种整合体系的相互关系:
• 基因组作为信息载体 （碱基对、重复序列的整 体守恒与局部不平衡的关系） • 基因组作为遗传物质的整合体 (基因作为功能和 结构单位与遗传学机制的关系) • 基因组作为生物化学分子的整合体 (基因产物作 为功能分子与分子、细胞机制的关系） • 物种进化的整合体 (物种在地理与大气环境中的 自然选择）
Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
大 规 模基因组 测 序 的 两种策略
• 逐步克隆法
（Clone by Clone）
• 全基因组霰弹法
（Whole Genome Shot-gun)
逐步克隆法（Clone by Clone）
完整的基因 组序列 基因组DNA
BAC文库 根据物理图谱 正确定位的 BAC 或contig
3pter
sts-N95054 SG -10790 002R42 C D3S3691A
SG -82788 C A 004Q43 SG -15279 W I-10858 C
sts-N30615 stSG W 3143 I-8499
stSG 50796 W I-21858 W I-20982 SG -34652 C EST325005 Bda37h09 sts-N34454 stSG -22642 stSG IB262 22463 SG -100057 SG -11218 C C SG -77734 SG -12613 C C SG -79997 C D3S4170 W I-13469 SG -104744 W C I-7400 SG -106678 C W D3S4125 31571 I-3006 stSG C SG -86097 SG -104738 sts-T03421 81116 C stSG D3S3525 C D3S3630 SG -11976 W WSG -84074 D3S3706-102094 W I-6116 C SG -77858 SG I-2053 C C I-13611NRU18-13s W I-21921
人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这“四张图”上
• 遗传图谱 又称为连锁图谱（linkage map），指 基因或DNA标志在染色体上的相对位置 与遗传距离 • 物理图谱 以定位的DNA标记序列如STS作为路标， 以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的 基因组图谱。 • 转录图谱 利用EST（expressed sequence tags 表达 序列标签）作为标记所构建的分子遗传 图谱 • 序列图谱 通过基因组测序得到的，以A、T、G、C 为标记单位的基因组DNA序列
…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA
TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…
基因组学是一门大科学
• 基因组的信息是用来发现和解释具有普遍意义的生命 •
现象和它们的变化、内在规律、和相互关系。 基因组的信息含量高。基因组学的研究又在于基因组 间的比较。 基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入（各 生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、 物理学、电子工程学、考古学等）。 基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的 最前沿。 基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据。 人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性。
随机基因组序列
STS的来源 表达基因序列，如EST 遗传标记序列，如微卫星标记
有关STS的信息可在基因组数据库GDB中找到 http://gdbwww. gdb. org
物 理 图 谱 构 建 的 步 骤
确定各STS序列及其 在基因组中的位置
基因组数据库（GDB）中至少含有 24568 个STS路标信息
Helicos Genetic Analysis System Polonator G.007
Complete Genomics 无锡艾吉因生物信息技术有限公司
AG-100
Pacific Biosciences
RSSystem
深圳华因康基因科技有限公司
Pstar-1
中科院北京基因组所/半导体所
作为载体的基本要求
能在宿主细胞中进行独立的复制
具有多克隆位点，可插入外源
DNA片段 有合适的筛选标记，如抗药性
大小合适，易于分离纯化
拷贝数多
BAC文库的构建
每一个菌落为带有相同 外源DNA片段的单克隆
NotI、SacI
脉冲场凝胶电 泳得200Kb左 右的大片段 DNA
纯化后与载体 连接
1990 1995 2000 GA-I
SOLiD2
SOLiD
GA-II HiSeq1000/2000 GA-IIx
Year
2005 2010 2015 2020
8
测序设备发展现状
第一代（稳定需求） ABi
3130xL 3730xL 3500xL
第二代（高速发展） Roche
Genome Sequencer FLX System GS Junior System
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基因组与生命之谜
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基因组的产生与进化。 基因组DNA组分的变化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。 遗传密码的发生、发展和进化。 内含子（尤其是大于100，000 核苷酸的大内含子）剪 出后的运输和降解。 最小内含子的生物学意义。 动物基因组与植物基因组在基因分布上的共性和个性。 物种衍变过程中基因组水平的变化。 基因组大小变化与遗传、分子、细胞机制的关系。 “JUNK DNA”的发生、分类、进化与功能。
Illumina
Genome Analyzer IIx MiSeq HiSeq 1000 HiSeq 2000
Life Technologies (ABi)
5500 SOLiD™ System 5500xL SOLiD™ System Ion Torrent PGM™
DanaherMotion 第三代（即将面市） Helicos Biosciences
测序并进行 全基因组序 列组装
霰弹法克隆 用于霰弹法测 序的候选克隆
用于霰弹法测序 的亚克隆
测序并组装 ………ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA…… 完整的基因 ………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA… 组序列 …
基因组DNA
全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun)