第八章 酶的固定化

5.5 固定化酶的应用
1．固定化酶在工业生产中的应用

现已用于工业生产的固定化酶主要有： ① 氨基酰化酶 ② 葡萄糖异构酶 ③ 天门冬氨酸酶 ④ 青霉素酰化酶 ⑤ 延胡索酸酶 ⑥ β －半乳糖苷酶 ⑦ 天门冬氨酸-β -脱羧酶 ⑧ 脂肪酶 ⑨ 植酸酶
2. 固定化酶在酶传感器方面的应用


酶传感器是由固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离 子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置，是生物传感 器的一种。 广泛用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。
游离酶的不足：
1. 不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活，
即使在最适条件下反应；
2. 回收困难，不能重复使用：经济上不合算；
3. 反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。
酶的固定化
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固相酶、固定化酶） 固定化酶：固定在一定载体上并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶。
包埋法
离子键结合 法 共价结合法
交联法
可用的交联试剂多，技术简 反应条件较激烈，致使酶活力损失较大， 易，酶的结合力强，稳定性 而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用 高，可长期使用 带来不便。
制作方便，酶活力高，稳定 只适用于热稳定性好的酶 性高
热处理法
5.1.3 固定化酶的特性
（1）酶的活性 ：
5.2 细胞固定化
固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、
繁殖、新陈代谢）的细胞。
固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式 固定化细胞 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器 活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
微生物
细胞类型 植物 动物 生理状态
5.3 原生质体固定化

原因之一:细胞壁对物质扩散的障碍 原生质体
四、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间
发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联 法。 交联的形式：

（1）酶直接交联法 （2）酶与辅助蛋白交联法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化 方法
制备难易 结合程度 活力回收 再生 固定化成本 底物专一性 结合法 包埋法 难 强 低 不能 高 可变 较难 强 高 不能 低 不变 吸附法 易 弱 高，酶易 流失 可能 低 不变 交联法 较难 强 中等 不能 中等 可变
（4）酶的最适pH
a.载体性质的影响
带负电荷载体 ： 带正电荷载体 ： 最适pH 向酸性偏移。
b. 产物性质对最适pH值的影响
产物为酸性：最适pH值高一些； 产物为中性：最适pH值一般不改。
最适pH 向碱性偏移。 产物为碱性：最适pH值低一些；
（5）米氏常数 米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。使固定化酶Km变
固定化酶的优点

增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效 率，降低成本

易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化 提纯工艺

酶反应过程可严格控制


较游离酶更适合多酶反应
增加产物收率，提高产物质量
5.1.1 酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
结合法
交联法
包埋法
离子键 结合法
共价键 结合法
网格型
微型
B. 半透膜包埋法(微囊）：
将酶或细胞包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微
米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成
固定化酶或固定化细胞。(适用于产物、底物分子量小的）
① 常用载体———半 透膜有：聚酰胺膜、 火棉胶膜 ② 制备方法：将酶液 滴分散在与水互不相 溶的有机溶剂中，再 在酶液滴表面形成半 透膜，将酶包埋在微 胶囊之中。
离子键
易 中等 高 可能 低 不变
共价键
各种酶固定化方法的比较
方 法 优 点 缺 点
吸附法
制作条件温和、简便、成本 结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素 低、载体再生、可反复使用 敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小 操作简单，固定化酶活力较 仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系 高，适用性广。 统，常有扩散限制问题 条件温和，操作简便，活力 由于离子键结合力弱，酶与载体之间结合 损失小，结合量大。 不牢固，在pH、离子强度等条件改变时， 酶易脱离。 载体与偶联方法可选择性大 偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高， ；酶的结合力强，非常稳定 某些偶联试剂有一定毒性，制作较繁琐
微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得 (1)保护了原生质体 (2)利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌

一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。 常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树
脂。

注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。
（二）固定化原生质体的特点 有利于胞内物质的分泌 稳定性好 有利于产物的分离纯化 需添加渗透压稳定剂
1. 同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次的使用； 2. 易与底物、产物分开有利于控制生产过程；产物溶液
中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
3. 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性；
4. 较能适应于多酶反应；
5. 提供了研究酶动力学的良好模型。
固定化酶的缺点：
（1）酶固定化时酶的活力有所损失。
（2）增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 （3）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （4）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅 因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。
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生物传感器原理图
本章重点





何谓固定化酶？ 酶的常见固定化方法有哪些？分别以什么为载体？ 如何操作？各自有何优缺点？ 相对游离酶，固定化酶有何优缺点？经过固定化以 后酶的催化特性有何改变？ 固定化酶活测定的方法？ 什么是固定化细胞和固定化原生质？ 固定化酶的应用
通常低于天然酶（有例外）。
（2）酶的稳定性 酶的热稳定性、储存稳定性、操作稳定性以及对变性剂、 抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展 变形；
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。
（3）酶的最适温度
最适温度变化不大。
有些酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有 例外）。
动的原因，主要是由于载体与底物间静电相互作用。
固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观 Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。
（6）底物特异性

作用于低分子底物的酶 特异性往往会变化。
特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶
固定化酶的优点（与游离酶比较）：