有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验
探究产品免疫增强免疫实验(从淋巴细胞数目及活性角度)
× 100%
细胞活力检测：
（死细胞被台盼蓝染成蓝色，活细胞不着色）
谢谢观赏
小心将上述血液加在分离液面之上。 • 平衡，2000转／分; 20分钟。 • 用滴管直接插入PBMC，吸取PBMC 。 • 在PBMC中加入5mlPBS液，充分混匀。 • 1000转／分; 10分钟.弃去上清液，即获得纯PBMC。 • 加PBS液到终体积为1m1，混匀。
实验步骤
• 取上述提取的PBMC溶液1滴+台盼蓝1滴，混匀， 染色5-10分钟。
免疫细胞分离一般原理
➢ 种类、密度、内容物不同 ➢ 表面标志(如分化抗原) ➢ 生物学特性和其它活性：吞噬、粘附
密度梯度离心法的原理
• 根据各类血细胞的比重不同，采用分层液提取 淋巴细胞。PBMC与血液中的其他成分存在密度 差异。
• 利用密度在1.077±0.001g/L之间而且近于等 渗的淋巴细胞分层液作密度梯度离心时，各 种血液成分按密度梯度重新分布聚集。
红细胞
Hale Waihona Puke 1.093外粒细胞
周
血
单个核细胞
(PBMC)
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075
血小板
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
1、血浆和血小板密度较低，故悬浮于分层液上部， 2、红细胞和粒细胞密度较大，故沉于分层液底部， 3、PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液层面上， 这样就可以获得PBMC。
• 取上述提取的PBMC溶液1滴+3滴PBS，混匀 • 细胞计数板：上部分：加入为染色细胞
下部分：加入染色细胞
数上不数下，数左不数右。
计算方法
细胞计数板上半部分结果用于计算细胞密度： （4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数
实验三十四增强免疫力功能试验
实验三十四增强免疫力功能试验一、实验目的与要求1 熟悉动物实验的操作技术与要求；2 掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。
二、实验原理1 免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。
健全的免疫系统主要有三大功能：（1）防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；（2）稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；（3）监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。
2 机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。
三、实验仪器与试剂1 仪器（1） 200目筛网；（2） 24孔培养板；（3） 96孔培养板（平底）；（4）玻片架；（5）微量血凝实验板；（6）血色素吸管；（7）手术器械；（8）打孔器；（9）计时器；（10）二氧化碳培养箱；（11）超净工作台；（12）恒温水浴；（13）离心机；（14）酶标仪；（15） 721型分光光度计；（16）显微镜。
2 试剂（1）生理盐水；（2）丙酮；（3）甲醇；（4）盐酸；（5）异丙醇；（6） DNFB；（7）麻油；（8）硫化钡；（9） Na2CO3；（10） RPMI1640细胞培养液；（11）小牛血清；（12） 2巯基乙醇（2ME）；（13）青霉素；（14）链霉素；（15）刀豆蛋白A（ConA）；（16） Hank s液；（17） PBS缓冲液（pH7.2~7.4）；（18） SA缓冲液；（19）琼脂糖；（20）印度墨汁；（21） SRBC；（22）鸡红细胞；（23） YAC1细胞；（24）补体（豚鼠血清）；（25） MTT；（26） Giemsa染液；（27）乳酸锂或乳酸钠；（28）硝基氯化四氮唑（INT）；（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）；（30） NAD；（31） 0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）；（32） 1%NP40或2.5%Triton。
实验三十四增强免疫力功能试验
实验三十四增强免疫力功能试验一、实验目的与要求1 熟悉动物实验的操作技术与要求；2 掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。
二、实验原理1 免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。
健全的免疫系统主要有三大功能：（1）防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；（2）稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；（3）监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。
2 机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。
三、实验仪器与试剂1 仪器（1） 200目筛网；（2） 24孔培养板；（3） 96孔培养板（平底）；（4）玻片架；（5）微量血凝实验板；（6）血色素吸管；（7）手术器械；（8）打孔器；（9）计时器；（10）二氧化碳培养箱；（11）超净工作台；（12）恒温水浴；（13）离心机；（14）酶标仪；（15） 721型分光光度计；（16）显微镜。
2 试剂（1）生理盐水；（2）丙酮；（3）甲醇；（4）盐酸；（5）异丙醇；（6） DNFB；（7）麻油；（8）硫化钡；（9） Na2CO3；（10） RPMI1640细胞培养液；（11）小牛血清；（12） 2巯基乙醇（2ME）；（13）青霉素；（14）链霉素；（15）刀豆蛋白A（ConA）；（16） Hank s液；（17） PBS缓冲液（pH7.2~7.4）；（18） SA缓冲液；（19）琼脂糖；（20）印度墨汁；（21） SRBC；（22）鸡红细胞；（23） YAC1细胞；（24）补体（豚鼠血清）；（25） MTT；（26） Giemsa染液；（27）乳酸锂或乳酸钠；（28）硝基氯化四氮唑（INT）；（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）；（30） NAD；（31） 0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）；（32） 1%NP40或2.5%Triton。
筛选小分子免疫激动剂实验方法
筛选小分子免疫激动剂实验方法引言：小分子免疫激动剂是一类能够激活免疫系统的化合物，对于研究免疫调节、疫苗开发以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。
本文将介绍一种常用的筛选小分子免疫激动剂的实验方法，帮助研究人员快速、准确地评估化合物的免疫激活能力。
一、细胞系选择：选择合适的细胞系用于筛选小分子免疫激动剂。
常用的细胞系有人类单核细胞系（如THP-1、U937）、小鼠巨噬细胞系（如RAW264.7）等。
选择适合的细胞系要考虑到其表达的免疫受体、信号通路的完整性以及易于操作的特点。
二、细胞培养：将选定的细胞系培养在适宜的培养基中，通常为含有10%胎牛血清的培养基。
细胞应在37摄氏度的恒温培养箱中保持在5%二氧化碳气氛下培养。
培养基的更换和细胞的传代应根据细胞生长情况进行，并确保细胞处于良好的生长状态。
三、化合物处理：将待筛选的小分子免疫激动剂加入细胞培养基中，使其最终浓度在0.1-100μM之间。
同时设置阴性对照组和阳性对照组，以评估化合物的免疫激活效果。
阴性对照组通常使用培养基或溶剂，而阳性对照组则使用已知的免疫激活剂，如脂多糖。
四、免疫指标检测：在化合物处理后，通过检测免疫相关指标来评估小分子的免疫激活能力。
常用的指标包括细胞表面标记物的表达变化、细胞因子的产生以及信号通路的激活情况。
可以使用流式细胞术、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法进行检测。
五、细胞因子测定：细胞因子是免疫反应的重要介质，常用于评估小分子免疫激动剂的活性。
ELISA是常用的细胞因子测定方法，通过检测培养上清液中的细胞因子水平来评估化合物的免疫激活能力。
同时，可以使用多种细胞因子同时测定的方法，如Luminex技术，提高检测效率和准确性。
六、流式细胞术：流式细胞术是一种常用的细胞表面标记物检测方法，可用于评估化合物对细胞免疫表型的影响。
通过标记特定的细胞表面标记物，如CD80、CD86等，可以定量地检测细胞表面标记物的表达水平，进而评估化合物的免疫激活效果。
免疫反应测定实验报告
免疫反应测定实验报告引言免疫反应测定是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本实验旨在通过免疫层析法和酶联免疫吸附试验（ELISA）两种方法，对特定抗原进行定量检测，以评估该抗原在不同样本中的含量差异。
本实验具有重要的临床应用意义，可以为疾病的早期诊断、治疗效果的评估和流行病学调查提供有力的支持。
材料和方法样本准备从患者A、B、C和健康人D的血样中提取血清，并分别储存在-80的冰箱中。
在实验前，按照实验所需的样本体积，将冻存的血清缓慢化解至室温。
免疫层析法实验步骤1. 取出免疫层析试纸条，将其放在一块干净的平板上。
2. 使用移液器，分别滴加样本A、B、C和D的血清样品到免疫层析试纸条的不同孔上。
3. 等待5分钟，观察免疫层析试纸条上是否出现特定抗原的测定线。
酶联免疫吸附试验实验步骤1. 取出96孔板，将样品A、B、C和D的血清样品分别加入不同孔中。
2. 加入特定抗体，与样品中的抗原结合。
3. 加入辅助抗体，与已结合的抗原形成复合物。
4. 加入底物，使酶作用于底物并产生可测定的信号。
5. 使用酶标仪测定吸光度值，并根据标准曲线计算样品中特定抗原的浓度。
结果与分析免疫层析法结果分析通过免疫层析法实验，观察到样本A、B、C和D的免疫层析试纸条上均出现了特定抗原的测定线。
测定线的颜色深浅与抗原的含量成正相关，样本A的测定线最深，样本D的测定线最浅。
这说明样本A中的特定抗原含量最高，样本D 中的特定抗原含量最低。
酶联免疫吸附试验结果分析通过酶联免疫吸附试验，测定样本A、B、C和D中特定抗原的浓度。
根据标准曲线的吸光度值和已知标准品的浓度，计算出样品中特定抗原的浓度。
结果显示，样本A中特定抗原的浓度最高，样本D中特定抗原的浓度最低，与免疫层析法的结果相一致。
这说明两种方法均能准确测定特定抗原的含量，并得到相似的结果。
结论本实验通过免疫层析法和酶联免疫吸附试验两种方法，对特定抗原在样本A、B、C和D中的含量进行了定量检测。
免疫调节
免疫调节29．吸食吗啡等毒品的人群中艾滋病高发，为探究吗啡对HIV的影响，科研人员将某种溶剂配制的三种不同浓度的吗啡分别加入到T淋巴细胞系培养液中，再向培养液加入HIV毒株，实验结果如图所示．（1）将培养瓶放在恒温培养箱中培养，定期取细胞培养液离心，检测中HIV的数量．（2）实验中应设置对照组，具体操作是将加入到T淋巴细胞系培养液中，再向培养液加入HIV 毒株．随着HIV感染天数增加，对照组中HIV数量．（3）实验结果表明，三种浓度的吗啡均能HIV增殖，但是最大浓度（10﹣8mol/L）吗啡效果却并非最佳，科研人员推测其原因之一可能是高浓度吗啡会T淋巴细胞的增殖．（4）纳洛酮的化学结构与吗啡相似，可用于吗啡成瘾的临床治疗．科研人员进一步研究了纳洛酮对HIV增殖的影响，将不同试剂分别加入到被HIV感染的T淋巴细胞系培养液中，定期检测HIV的含量（10﹣3µg/mL），结果如下表．组别第3天第4天第5天第6天吗啡组 5.59 31.73 81.77 243.0吗啡和纳洛酮组 1.96 8.11 15.36 41.23纳洛酮组 1.97 8.10 15.81 42.30对照组 1.93 8.03 15.30 41.01①该实验中使用的吗啡浓度应为．②由实验结果表明，纳洛酮HIV的增殖，吗啡对HIV增殖的影响．29．（18分）IP10是人体某些细胞中表达的细胞因子，为探究IP10对肿瘤细胞免疫应答的影响，科学家进行了有关研究。
请分析回答：（1）在机体抗肿瘤过程中，特异性免疫和均发挥一定作用，细胞免疫过程中主要的效应细胞是。
（2）获取IP10基因，构建重组质粒并导入乳腺肿瘤细胞，筛选成功表达IP10的细胞命名为IP10细胞，将IP10细胞、乳腺肿瘤细胞和导入空质粒的乳腺肿瘤细胞分别在体外培养，定期取样、计数并绘制生长曲线，结果如图1，再将三种细胞分别接种于健康小鼠乳腺部位皮下，观察小鼠肿瘤生长状况，结果如图2。
增强免疫力功能试验
免疫实验技术实验报告模板
免疫实验技术实验报告模板一、实验目的1. 掌握免疫实验技术的基本操作流程。
2. 学习如何通过免疫实验技术检测特定抗原或抗体。
3. 理解免疫实验技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理免疫实验技术是一种利用抗原-抗体反应的原理来检测和定量分析生物样本中的特定分子。
通过标记的抗体或抗原与目标分子结合，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光、免疫电泳等方法来检测和分析。
三、实验材料1. 待测样本：血清、组织匀浆等。
2. 试剂：特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
3. 仪器：酶标仪、离心机、恒温水浴、显微镜等。
四、实验方法1. 样本准备：根据实验要求，将待测样本进行适当的处理和稀释。
2. 抗原-抗体反应：将待测样本与特异性抗体混合，进行孵育，使抗原与抗体结合。
3. 标记与检测：使用酶标记的二抗与一抗结合，通过底物反应产生可检测的信号。
4. 数据记录：记录实验过程中的各个时间点和条件，以及最终的检测结果。
五、实验步骤1. 样本稀释：将待测样本按照实验要求进行稀释。
2. 抗原-抗体孵育：将稀释后的样本与特异性抗体混合，放入恒温水浴中孵育一定时间。
3. 洗涤：使用缓冲液洗涤反应板，去除未结合的抗体。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，再次孵育。
5. 显色反应：加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色变化。
6. 光度测定：使用酶标仪测定各孔的吸光度，记录数据。
六、实验结果1. 数据展示：将测定的吸光度值以图表的形式展示。
2. 结果分析：根据吸光度值的变化，分析样本中目标分子的浓度或存在情况。
七、讨论1. 分析实验结果与预期的关系，讨论可能的原因。
2. 探讨实验条件对结果的影响，如孵育时间、温度等。
3. 提出实验中可能存在的问题及改进建议。
八、结论根据实验结果，得出结论。
说明免疫实验技术在检测特定抗原或抗体方面的有效性和准确性。
九、参考文献[1] 参考文献格式示例。
[2] 参考文献格式示例。
十、附录1. 实验原始记录。
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第五篇有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验第一章检测非特异免疫功能的实验第一节小白鼠碳粉廓清试验基本原理静脉注射一定大小的颗粒物质，迅速被肝、脾等器官内网状内皮细胞吞噬而使其在血浆浓度降低，因此可从其廓清率了解整个单核巨噬细胞系统的吞噬功能。
材料和仪器●印度墨汁●0.1%Na2CO3溶液●毛细滴管●72分光光度计操作步骤1．体重18一22g小白鼠，雌雄各半，随机分为实验组与对照组。
2．每鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/kg体重，于l（t1）和5（t5）分钟后分别从眼眶静脉取血20ul，加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀；3．用72型分光光度计在680mm下比色,测光密度（以下分别用OD1和OD5来表示l 分钟和5分钟所取血样的光密度）；4．按下式计算廓清指数K值：廓清指数K= LogOD1－logOD5=LogOD1/OD5 T5-t1 4K值经体重及肝脾重换算后．得吞噬指数α值：吞噬指数α＝体重／肝脾重×3k以X±ＳＤ来表示给药组与对照组的k值和α值，进行组间t检验，比较差异的显著性。
注意事项1.印度墨汁应用生理盐水稀释l一5倍左右。
最好经超声处理后离心，弃出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛细血管，引起动物致死。
2.尾静脉注射要熟练，取血时间也可延长至10分钟，但必须准确无误。
参考文献刘辉2000 研究生免疫学教程大连大连出版社258-259（张璐刘辉）第二节小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验基本原理通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
材料和仪器●5％鸡红细胞生理盐水悬液●37℃孵箱●固定液：1:1 丙酮－甲醇溶液●染色液：4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液●垫有湿纱布的搪瓷盒操作步骤1 取体重18一22g 的健康小白鼠．随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对照组。
2每鼠腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。
38-12小时后,颈推脱臼处死小鼠；正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2m1，轻轻按揉鼠腹部1分种，然后吸出腹腔洗液lml，分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30分钟。
4以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。
51:1 丙酮－甲醇溶液固定5分钟。
64％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液染色3分钟，用流水冲洗，晾干。
7结果判定：油镜下计数巨噬细胞，每片200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数×100% 200个巨噬细胞（吞及未吞噬的）吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞÷2 ２００个巨噬细胞在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能．通常分为4级：Ｉ级：未消化。
被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。
II级；轻度消化。
胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。
III级：重度消化。
胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。
IV级：完全消化。
巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐．胞核隐约可见。
注意事项1.实验过程中应注意无菌操作。
2.若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前3—4天，腹腔注射0.5％淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml。
免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。
3.若滴片染色过深，可用1％HCI脱色；过浅则可复染。
4.每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。
由小鼠腹腔吸出的液体为出血性渗出液时，不宜使用。
5.必要时用低渗法溶解胞外红细胞，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。
6.本法简便．但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。
参考文献1.巴德年1998当代免疫学技术与应用．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，261－263（张璐刘辉）第三节溶菌酶测定法（光学法）基本原理体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。
材料与仪器●菌种；溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。
●PH6.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）：①1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。
②1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠·2H2O11.87g，加蒸馏水至1000ml。
③PH6.4, 1/15M PBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml, 1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠0.5g 混匀，溶解即成。
●溶菌酶标准品：结晶纯品。
●5N氢氧化钾：氢氧化钾56g加蒸馏水至200ml。
●分光光度计操作步骤1.菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混悬菌液。
用分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。
2.溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15M PBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。
临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。
3.检品应根据估计溶菌酶含量作适当稀释．取适当稀释（或不稀释）检品0.2ml放小试管内。
置37 ℃水浴箱预热5分钟，再向管内加人预热的菌液1.8ml混匀，立即记下开始时间，至2分钟时加入1滴5N氢氧化钾停止反应，立即将菌液倒入比色杯内．用640nm 滤光板，0.5cm比色杯测其透光率T1%。
4.另取同样浓度的检品0.2ml．先加入1滴5N氢氧化钾摇匀，在37℃预热５分钟，再加入1.8ml经37℃预热的菌液，在同样温度下2分钟后同法测定其透光率Ｔ0。
T１／一Ｔ0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化，从标准曲线上可查得检品中溶菌酶含量。
5.计算：以0.2ml各种浓度的溶菌酶标准液代替检品，操作步骤与待检品相同。
以不同浓度标准液测得的透光率差值为纵坐标（对数坐标），溶菌酶浓度为横坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。
按检品的T％（2分钟的读数减去零时的读数）查出其对数，由标准曲线上查出稀释的检品中溶菌酶的含量，乘以稀释倍数，即为检品中溶菌酶的含量。
注意事项溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻涕、白细胞和血清等。
测定它在体液或分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能一个指标。
在选择标本及评价其意义时应予以注意。
参考文献刘辉2000 研究生免疫学教程大连大连出版社260－261（张璐刘辉）第四节溶菌酶测定法（平板法）基本原理体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，在混有菌液的琼脂疑胶上打孔，将检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环的直径。
可反映溶菌酶的活性。
材料与仪器●菌种：溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。
●PH6.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）①1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。
②1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠·2H2O11.87g，加蒸馏水至1000ml。
③PH6.4, 1/15M PBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml, 1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠0.5g 混匀，溶解即成。
●溶菌酶标准品：结晶纯品。
●普通琼脂培养基操作步骤1.菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混悬菌液。
用72型分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。
2.溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15M PBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。
临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。
3.加热融化1.2%琼脂粉，待冷却至60-70℃时将溶壁微球菌混入摇匀，使其浓度为1mg/ml，立即倾入已夹好的两玻片中（厚度为4mm）。
4.待琼脂凝固后，以15mm间隔，用打孔器穿钻2.5mm直径小孔，每孔中加入20ul检样品，并在同一板上加上不同浓度的标准溶菌酶样品，置24-26℃，12-18小时，用测微尺测溶菌环的直径。
5.用半对数纸（以溶菌酶浓度为纵坐标，即对数坐标，溶菌环直径为横坐标）绘制标准曲线。
从线上查出每毫升样品所含溶菌酶的ug数。
注意事项在缺乏培养细菌的条件下也可使用干菌粉，将溶壁微球菌24小时培养物用60倍体积蒸馏水洗下，离心沉淀弃上清液，沉积的菌体加约5倍体积的丙酮，用玻棒搅匀，放冰箱内30分钟、取出离心沉淀弃上清液。
按此法用丙酮浸洗3次，再用乙醚洗2次，将菌体放于燥器内过夜，即得干菌粉。
用乳体研碎备用，使用时称干菌粉500mg，放人上述磷酸缓冲液约50ml，如上调整菌液浓度约30一40%.参考文献刘辉2000 研究生免疫学教程大连大连出版社260－261（张璐刘辉）第二章检测特异性免疫功能的实验第一节血清溶血素测定基本原理经绵羊红细胞（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素）。
并释放至外周血。
这种抗体在试管内与SRBC温育．在补体参与下可产生溶血反应．免疫动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。
材料与仪器●SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.8g，蒸溜水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。
●都氏试剂（测血红蛋白用）；碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸馏水1000ml。
●补体：新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:1）于4℃吸收30分钟后置-20℃以下备用。
●SRBC：在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2 倍量的保存液，置4℃冰箱备用。
临用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。
操作步骤1.免疫；小鼠腹腔注射20％SRBC 0.2ml／天，免疫后第4天去眼球或腹动脉取血，分离血清，将血清稀释（一般500倍以上）后供测定。
2.溶血反应：反应管内依次加人经稀释的血清lml，5％SRBC0.5ml，10％补体lml．置3.37℃恒温水浴中保温30分钟，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5分钟，取血清液lml加都氏试剂3ml，摇匀放置10分钟，于540nm波长比色读取吸光度。