肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
细胞培养技术的最新进展
细胞培养技术的最新进展细胞培养技术在医学、生物学和药学等领域中发挥着重要作用。
随着生物技术的快速发展，细胞培养技术也在不断进步。
近年来，细胞培养技术的最新进展主要表现在以下几个方面。
一、三维细胞培养技术传统的细胞培养技术是在二维平面上进行的，存在一些局限性。
而三维细胞培养技术则可以更好地模拟生物体内细胞的生长环境，进而更好地研究细胞的生理和病理过程。
例如，以组织工程为基础的三维细胞培养技术可以用于修复组织和器官的缺陷，开发基于组织的新型治疗和疫苗。
二、细胞芯片技术细胞芯片技术是一种通过微电子技术制备微型细胞培养基板的技术。
这种技术可以实现快速、大规模、无污染的单细胞或多细胞分析，进而用于肿瘤学、基因组学、药物筛选等研究领域。
与传统方法相比，细胞芯片的优势在于高通量、高灵敏度和高自动化。
三、干细胞培养技术干细胞培养技术是指将干细胞保存在特殊的培养条件下，控制其生长和分化，最终得到一定类型的细胞。
这种技术可以用于再生医学、药物筛选和疾病模型的建立等领域。
近年来，不断有新的干细胞培养技术被开发出来，如诱导多能干细胞、直接重编程等。
四、多样化的细胞培养基细胞培养基是指用于培养细胞的营养液。
传统的细胞培养基是通过研究已知条件下的细胞生长要求得到的。
然而，不同种类的细胞在生长过程中需要不同的环境因素。
最新的研究表明，通过定制细胞培养基可以更好地模拟细胞在生物体内的生长环境。
而且，多样化的细胞培养基可以用于更广泛的细胞类型和应用，促进细胞增殖和差异性维持。
五、纳米技术在细胞培养中的应用纳米技术可以制备出具有降解性、生物相容性和导电性等特性的材料。
这种材料可以被用于制备高效的细胞培养基，以及控制细胞形态和大小等方面。
通过将纳米技术应用于细胞培养中，可以更好地模拟生物体内的环境，提高细胞的存活率和增殖率。
综上所述，细胞培养技术的最新进展凸显了生物技术的快速发展和不断进步的力量。
虽然这些新技术仍然存在一些局限性，但它们为细胞生物学和临床医学的发展带来了新的机遇和挑战。
肿瘤干细胞的分离方法
肿瘤干细胞的分离方法肿瘤干细胞（tumor stem cells）是肿瘤组织中一小部分细胞群的亚群，具有自我更新、自我复制和多向分化的能力，能够发起和维持肿瘤的生长和进展。
肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤的一个重要特征，因为它们在肿瘤的发展、转移和复发中起着重要的作用。
因此，肿瘤干细胞的分离与研究对于了解肿瘤的发生机制、寻找新的治疗策略以及改善临床预后具有重要的价值。
下面将介绍几种常用的肿瘤干细胞的分离方法。
1. 黑色素瘤干细胞（melanoma stem cells）分离方法：a. 表面标记法：利用特定的细胞表面标记物，如CD271、ABCB5等，可以通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技术，将肿瘤干细胞从肿瘤组织中分离出来。
例如，采用CD271阳性细胞的FACS来分选肿瘤组织，可以得到具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群。
b. 功能分选法：通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化能力，可以利用体外球形培养（spheroid culture）技术分离肿瘤干细胞。
相比于非干细胞，干细胞可以形成独立的球形结构，并表达特定的干细胞特性标记物，如ALDH1（aldehyde dehydrogenase 1）等。
2. 乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells）分离方法：a. 流式细胞术：利用特定的细胞表面标记物，如CD44和CD24，可以通过流式细胞术将肿瘤干细胞从乳腺癌组织中分离出来。
例如，CD44+/CD24-细胞的分选可以得到乳腺癌中富含干细胞的细胞亚群。
b. 磁性珠分选法：通过特定的标记物，如EpCAM（epithelial cell adhesion molecule）和CD44，可利用磁性珠（magnetic beads）结合的方法将肿瘤干细胞从乳腺癌组织中分离出来。
3. 前列腺癌干细胞（prostate cancer stem cells）分离方法：a. 表面标记法：利用特定的细胞表面标记物，如CD44和CD133，可以通过流式细胞术或磁性珠分选法将肿瘤干细胞从前列腺癌组织中分离出来。
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用随着科学技术的不断进步，干细胞技术已开始被应用于临床治疗中，尤其是在肿瘤治疗中。
干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新和分化成多种细胞类型的潜能，因此被广泛研究并用于临床治疗。
本文将介绍干细胞技术在肿瘤治疗中的应用，包括干细胞移植、干细胞免疫治疗和干细胞治疗耐药性肿瘤等方面。
一、干细胞移植在干细胞移植中，一种或多种类型的未分化干细胞被通过手术移植到患者的体内，以代替已经损坏或死亡的细胞并恢复组织的功能。
这是一种广泛应用于肿瘤治疗中的治疗方法，可用于恢复因癌症治疗而导致的非造血细胞的缺陷和免疫系统的功能，通过提高治疗的效果和减少治疗后的不良反应，以改善患者的生存率和生存质量。
在干细胞移植中，研究人员通常使用的干细胞类型是造血干细胞和淋巴细胞。
造血干细胞可以分化成一个或多个血细胞系列的血细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。
淋巴细胞则是免疫系统的主要细胞组成部分，可以分化成效应细胞和记忆细胞，以激发和保持免疫反应。
二、干细胞免疫治疗干细胞免疫治疗是应用干细胞的一种新型治疗方法，旨在改善免疫系统对肿瘤的反应。
在干细胞免疫治疗中，研究人员通常使用的干细胞类型是免疫干细胞和肿瘤干细胞。
免疫干细胞可以从患者或捐赠者体内获取，并在实验室中培养和扩增。
此后，这些免疫干细胞可以重新注入到患者体内，以增加免疫系统对肿瘤的反应。
肿瘤干细胞则是从患者或捐赠者体内获取的未分化细胞，这些细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，可以通过适当的刺激和诱导分化成免疫干细胞。
在肿瘤干细胞分化后，它们可以被使用在干细胞免疫治疗中，以增强免疫系统的对肿瘤的反应。
三、干细胞治疗耐药性肿瘤肿瘤的耐药性是指肿瘤细胞在作用于其上的化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段后不再受治疗影响，导致治疗的难度加大。
干细胞的优势在于它们可以定向分化成给定细胞类型，并因此用于治疗耐药性肿瘤。
研究人员利用干细胞为药物输送增加了非常有前途的传递方式，如包括导向药物输送、控制释放、检测和修复损伤组织等。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
肿瘤干细胞名词解释
肿瘤干细胞名词解释肿瘤干细胞是一种特殊类型的细胞，可以通过不同方式来发展成其它类型的细胞，从而为肿瘤细胞提供利用或被肿瘤细胞所利用的能力。
其广泛应用于肿瘤研究，为肿瘤研究和治疗提供了新的方法。
肿瘤干细胞是细胞培养技术的重要组成部分，广泛用于生物医学研究的各个领域，如癌症研究、细胞生物学和细胞分子生物学等，已成为肿瘤研究的一个主要部分。
肿瘤干细胞具有多重特性，基本上可以被归纳为三类：肿瘤母细胞、肿瘤前体细胞和肿瘤细胞。
肿瘤母细胞是指能够自动复制的细胞，可被肿瘤细胞长期利用的细胞。
它们有着复杂的分子和结构特征，通常具有自我重组和自我复制的能力，比肿瘤细胞更加强大。
比起肿瘤细胞，肿瘤母细胞更加稳定。
它们可以被肿瘤细胞长期利用，作为攻击身体细胞的“坦克”而被肿瘤细胞利用。
肿瘤前体细胞是指生成肿瘤细胞的细胞，是肿瘤发展的最初状态。
肿瘤前体细胞具有两个重要特征：一是非常脆弱，易受损害，可以被抗癌药物破坏；二是它们具有某种能力，可以与其它细胞融合，形成新的细胞，肿瘤细胞也是其中一种。
肿瘤细胞是最重要的肿瘤细胞，是肿瘤的核心，它们可以通过一系列的过程来复制自身，并向周围组织繁殖，最终形成肿瘤组织。
具有特殊的生物学特性，如具有强大的抗药性和耐受性，很难被抗癌药物抑制。
肿瘤干细胞在肿瘤研究中有着重要的作用，可以对肿瘤细胞的功能和生长进行有效控制。
在诊断阶段，它们可以帮助评估患者的疾病状态和治疗效果；在治疗阶段，它们可以用于新型抗肿瘤治疗的开发，为肿瘤的治疗提供有力的支持。
总之，肿瘤干细胞是肿瘤研究的重要组成部分，具有自我复制能力和肿瘤细胞长期利用的特性，可以用于诊断和治疗肿瘤，成为新型抗肿瘤疗法研究的有力支持。
肿瘤干细胞的研究和应用，有助于我们更好地理解肿瘤病理生物学，更有效地治疗肿瘤。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
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肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
一、肿瘤干细胞培养中几种常见得细胞因子(一)白血病抑制因子ＬIF(leukｅmｉn ｉnhibitｏｒｙ faｃtｏr,LIF) 就是白介素６(ＩL-6)细胞因子家族中得一员,就是典型得多功能生长因子,具有多种生物学功能:对细胞生长、增殖与分化有着广泛得作用,抑制分化促进干细胞增殖。
胚胎干细胞得体外培养需要添加LIＦ以抑制其分化,维持其多能性。
LＩF 可抑制成纤维细胞生长因子(Fｉｂrｏbｌast Growth Faｃtor ,ＦGF)、β转移生长因子(β—transforminｇ Gｒowｔh Ｆactoｒ,TＧFβ)与叶酸(Rｅtin ｏｉc Aｃid ,RＡ)诱导得细胞分化。
(二)干细胞因子(ｓtem cell ｆactｏr,SCＦ) 又称肥大细胞生长因子(MGF),Kit配体(KL)及Steel因子(SＬF),SCF可以诱导干与祖细胞增生。
ＳCF 主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中得基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。
SCF就是一种作用于最早期造血干祖细胞得造血细胞因子,在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖与分化、调控各系造血细胞得生长发育过程中起着重要作用。
(三)表皮生长因子(epiｄermal growth faｃtｏｒ,ＥGＦ) 就是含有53个氨基酸得多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长得作用,就是表皮细胞培养得最常用得添加因子之一、EGＦ可显著促使细胞分裂、增殖,在一定浓度范围内(5~20nｇ/ｍl),随EGＦ浓度提高,效应加强。
(四)碱性成纤维细胞生长因子(ｂasic ｆibｒobｌａst grｏｗth fａcｔor,bＦGＦ) 1９７5年Gｏｓpodarowicｚ及其同事从牛大脑与垂体中分离纯化出一种分子量为1６—18kD由146个氨基酸组成得阳离子多肽,并将其命名为成纤维细胞生长因子、bＦGF具有多种生物学功能,可以促进与调节血管内皮细胞、上皮细胞、与神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性得许多种细胞得增殖与分化。
二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定与培养。
不同组织来源得肿瘤特性不同得,培养条件也不完全相同,本章就已有报道得从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离得肿瘤干细胞得体外培养体系加以阐述,在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同得肿瘤干细胞建立稳定得体外培养条件。
(一)白血病干细胞 ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD３４＋/CD10–／ＣＤ１９–)采用悬浮培养体系培养[２]。
ＡLL急性淋巴细胞白血病患者来源得骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNＣ),使用IＭDＭ(Gibco)添加５0% FCS(Gibcｏ)与10％ DＭSO二甲基亚砜(Manｏr PａrｋPｈarmaceuticａｌs)冻存液将分离得到得MＮC在液氮中备用。
培养时以5×1０5个/ｍL密度接种在IMＤM无血清培养基中,添加了10μg/mＬ人胰岛素,２00μg／ｍL转铁蛋白( Ｓigｍa—Al ｄrｉch)与2％ HAS。
使用时以下两组生长因子任选其一:①20ng/ｍL重组人Fm ｓ样酪氨酸激酶3 (rhFlｔ3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (ｒｈIL—３)、20ng／ｍL rｈIＬ-6、2０ng/mＬrhＧM—CSF、20nｇ/ｍL rhＧ-CSF与5０ng/mL SCF。
②20nｇ／mＬrhＩL－3、1０ｎg/ｍL ｒhIL—7与５０nｇ/ｍＬＳCF (R ＆D Ｓystｅms)、每周半量换液一次,培养6周后收集细胞用于细胞遗传学与形态学分析。
(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Mａx Wicha及其同事建立得人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系［3］,在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长,我们称之为乳腺干细胞球。
原代培养时在超低粘附板(Corning)以2０000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。
无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基ＭEGM(BiｏWhittaｋer),添加了B27 (Invitrogen)、20ng/mｌ EGＦ、2０nｇ/mLbFGF(BD Bｉoｓcienｃｅs)与4μｇ/mL肝磷脂(Sｉgma),不添加牛垂体浸膏、乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05％胰酶与0．53ｍM ＥDTA-4Ｎa消化10分钟(Invitrｏｇｅｎ),收集细胞到离心管中８00rpm离心。
离心后得到得细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察就是否为单个细胞。
10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连得团块数量应该在30到15０之间,如果细胞团大于〉１0０需要重复进行消化与过滤得步骤。
外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD4４+ / ＣD24− /ｌoｗ)得培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理,在胶原酶(Rｏcｈe)与透明质酸(Sigmａ)按1:1比例配成得消化液中37℃消化2小时后通过３0μm滤膜后得到单细胞悬液。
以100０个/mL无血清DMEM－F１２ (Cambrｅｘ), 添加10ng/mL bF ＧF、 2０ng/mL EGF、5μg/m L胰岛素与0.4％牛血清白蛋白(Sｉgma)。
细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长,每隔3天使用胰酶－ＥDＴA消化2分钟后传代［４］。
乳腺癌细胞系ＭCF-7与MＤA—MＢ-231中分离得到乳腺癌干细胞(CＤ24−／l ｏｗ／ＣD44+),收集细胞５00g离心5分钟,使用Ｈanｋs’缓冲盐溶液洗涤后以１０00个/mL重悬于无酚磺酞得ＤMEM –Ｆ12 (Cellｇrｏ) 添加0、4%牛血清白蛋白BSＡ(Sigma)、５μg/ｍＬ牛胰岛素(Sigｍa)、20ｎg/mL bFGF ( Sigmａ)与1０ng／mL ＥGF (Ｓｉgma) ,每三天换液一次［５］。
(三)脑胶质瘤临床获得得肿瘤标本使用lympｈolｙte－M (Cedarlanｅ)去除红细胞,在充氧得人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液,总得来说,每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。
肿瘤细胞使用TSM(tumｏr spｈere medｉum)肿瘤细胞球培养基,添加20 ng/mｌ重组人ＥGＦ (Ｓigma)、20nｇ／ｍl ｂFＧF (Upｓtate)、10ng/mｌ LＩF(Ｃhemiｃon)、１×神经元存活因子NＳＦ(Ｃlonetiｃs)与60μg／ml Ｎ－乙酰半胱氨酸(Ｓｉgma), 使用60－ｍm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为３×106。
原代培养三天后免疫磁珠分选得到CＤ133+脑胶质瘤干细胞,使用上述细胞培养基培养［6］。
也有学者从临床肿瘤组织获得得单个肿瘤细胞悬液在Neuroｂaｓal培养基(Invitｒogen),添加2mM L—谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、Ｂ27 (Ｉnvitrogen)、20ng/ml ｈrEGF (Ｉnviｔrogeｎ)、2０ng／ml hrbFGＦ (Ｉnvｉtrogen)与5０mｇ/mｌＢSA。
实验中使用得细胞应该在4代之内,分选得到得Nestiｎ＋／CD13３＋细胞即为脑肿瘤干细胞[7］。
大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选得方法得到脑胶质瘤干细胞［8］, 在１００—mｍ培养盘中(Nunc)使用无血清得ＤMEM培养,添加了１0μg/mｌ牛胰岛素、1０0μg/ml人转铁蛋白、1０0μg/ｍl BSA、60ｎg/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、4０ng／mｌ亚硒酸钠、63μg/ｍl N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskoliｎ、50units／ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBＣO)、1０ng ／ｍｌbFGＦ与10ng/ml PDGF、大鼠胶质瘤细胞系9L,无血清NＳC增殖培养基采用DMEＭ/F1２添加20ng/m ｌEGF(Peproｔech)与bFGF(Pｅpｒoｔeｃh)、50ｎｇ／ml肝磷脂、１×B27 (Ｇibcｏ)。
每隔两天换液一次。
当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0、1%胰酶与1×EDTA (Gibco) ３７°C消化1０分钟。
通过2５μm细胞滤膜(BD Bｉosｃｉｅnｃes) 以100０个／mｌ密度接种在添加促有丝分裂剂得NSC培养基中每隔两天换液一次,1８天后可以进行细胞得传代,培养得细胞球即为具有化疗抵抗与侵袭能力得肿瘤干细胞样细胞［9］。