土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测
产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定_顾真荣
上海农业学报2001,17(3):92～96 Acta Agriculturae Shanghai 文章编号:1000-3924(2001)03-92-05产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定顾真荣 马承铸(上海市农业科学院植物保护研究所,上海201106)韩长安(上海市农业技术推广服务中心,上海201103) 摘 要 从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌,用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G 1、G 2和G3。
经鉴定,G1为短芽孢杆菌(Bacillus brevis );G2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis );G3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。
它们在几丁质平板上的透明圈直径以G1>G 3>G2为序,在以Schales '法测定壳聚糖酶活力时,其摇瓶发酵上清液的酶活力以G 3>G1>G2为序。
本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。
关键词 芽孢杆菌;几丁质酶;筛选;鉴定;测定中图分类号:Q 55;Q 939.124 文献标识码:A 几丁质又称甲壳素,是广泛分布于自然界的生物多聚物,每年都有上百亿吨的生物量产生,数量仅次于纤维素。
几丁质和几丁质酶的利用一直是生命科学中的重大课题,在环境保护、医学、化学和农业等方面具有重大的潜在应用价值[1,2]。
几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中。
细菌的几丁质酶由于潜在的商业用途倍受人们关注,粘质沙雷氏菌(Serratia marc enscens )是人们长期来研究的热点[3]。
对环境和卫生方面安全的芽孢杆菌亦有较多的研究。
已报道能产几丁质酶的芽孢杆菌有环状芽孢杆菌(B .circulans )[4,5]、蜡状芽孢杆菌(B .cereus )[4]、地衣芽孢杆菌(B .licheniformis )[4]和枯草芽孢杆菌(B .subtilis )[4,6]。
几丁质酶基因对根际微生物群落结构与生态作用的影响
几丁质酶基因对根际微生物群落结构与生态作用的影响微生物群落是土壤生态系统中最复杂的生态系统之一，包括许多种类的微生物，如细菌、真菌、古菌等。
这些微生物在土壤中发挥着重要的作用，如固定氮、分解有机物质、促进营养元素的循环等。
根际微生物群落是微生物群落中重要的组成部分，与植物生长和健康密切相关。
其中，几丁质酶是具有高度生物催化活性的酶类，对环境保护和农业生产具有重要的意义。
本文将从几丁质酶基因的角度探讨其对根际微生物群落结构与生态作用的影响。
几丁质酶基因是一类广泛存在于微生物中的酶基因，具有高度的生物学功能和生物催化作用。
这类酶可以分解几丁质，一种结构特殊的多糖物质，被广泛应用于食品、医药等领域。
然而，几丁质酶不仅仅是一种有价值的生物材料，还对土壤中的营养元素循环、微生物群落结构与功能等方面具有重要的影响。
几丁质酶基因在根际微生物群落中具有重要的功能。
研究发现，几丁质酶基因的存在可以促进根际微生物群落的多样性和稳定性。
一方面，几丁质酶可以分解几丁质等多糖类物质，将其转化为可被微生物利用的低分子营养物质。
另一方面，几丁质酶的活性会吸引一部分微生物群落中的优势菌株，进而形成稳定的微生物生态系统。
这种吸引力的机制与生物气味相关，这些生物气味可以被微生物识别并且感知，使得微生物能够在土壤中寻找到适合其生长和繁殖的环境。
除了稳定微生物群落外，几丁质酶基因还可以促进根际微生物群落的互惠共生效应。
互惠共生是指不同生物之间的相互作用，其中每一方都可以从中获得益处。
在根际微生物群落中，植物根系分泌物和微生物之间存在着复杂的互动关系。
这些根分泌物中含有多种有机和无机物质，可以为根际微生物群落提供生长和繁殖的基础。
几丁质酶基因的存在可以促进微生物吸附于植物根系表面，形成一层具有保护和降解能力的生物膜，有效地防止土壤侵蚀和水土流失等现象的发生。
此外，几丁质酶基因对根际微生物群落的生态保护和治理具有重要的意义。
根据研究发现，几丁质酶基因的存在可以阻止或减少有害微生物对植物生长的影响。
土壤几丁质酶的测定方法
土壤几丁质酶的测定方法我折腾了好久土壤几丁质酶的测定方法，总算找到点门道。
说实话，一开始我真的是瞎摸索，走了不少弯路。
我最开始尝试的时候，都不知道从哪儿下手。
只知道要把土壤样本准备好。
土壤样本的采集可不能马虎，就好比我们做饭选食材，得找那种有代表性的土壤，你不能专挑个特殊的小角落取土，得在一片区域不同点采集然后混合起来。
采好的土还得处理呢，我一开始就忽略了杂质的影响，以为只要是土就行，结果大错特错。
这就像淘米一样，你得把土壤里的小石头啊树枝啊啥的都去除干净。
后来到了测定几丁质酶的核心步骤。
我试过用那种常见的比色法。
这过程就像是一场化学反应的魔术。
首先要把土壤样品和含有几丁质底物的溶液放到一起，然后让它们充分反应一段时间，这个时间得控制好，就像烤蛋糕定时间似的，我第一次就没控制好，不是太长就是太短，整得结果乱七八糟的。
接着呢，就要加入一些显色剂，当这个显色剂一进去，溶液就会变色，这个颜色的深浅就和几丁质酶的活性有关系啦。
这里面最难的就是要制作标准曲线，我也是试了好多次。
最开始我对这个标准曲线的制作理解得不太透彻，按照书上的步骤做也老是出错，不是浓度算错了，就是点标错了，就像在迷宫里盲目地找出口一样。
后来慢慢就明白，每一步都得特别仔细，仪器读数的时候眼睛瞪得老大，就怕看错。
还有一种方法我还在摸索，就是那种采用荧光标记底物的检测法。
这个嘛，理论上它看起来挺不错的，感觉更灵敏呢。
不过目前我还不确定具体要怎么把这个方法和我的实验条件调到最佳状态，还得继续尝试。
但是呢不管用哪种方法，准确吸取溶液的量是超级重要的，哪怕是一点点的偏差，最后结果可能就差很多，就像厨师做菜盐撒多撒少差很多是一个理儿。
反正测定土壤几丁质酶的方法就是得不断试错不断总结经验。
在处理土壤样本的时候我还犯过个错误，没注意样本存储的温度和湿度，搞得好几次样本可能变质了，测定结果那肯定是不对的。
所以啊要是你们要做这个测定，样本存储环境一定得好好控制，就像我们保存食物要有合适的冰箱温度一样。
快速、准确鉴别产几丁质酶菌株的新方法
快速、准确鉴别产几丁质酶菌株的新方法胡晓;张敏;刘彭强;邓秋蕾;舒凯【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2010(36)4【摘要】使用几丁质平板法筛选具有几丁质酶活性的细菌时,由于几丁质平板本身趋于透明,而降解环也为透明色,不易观察到明显的抑菌圈,故在筛选几丁质降解菌时,其观察结果受人为因素影响较大.本文首次使用刚果红染色的方法,对几丁质平板进行染色,降解环为浅红色,而未降解部分为深红色;结果表明,降解环的直径大小随着接种时间的延长而逐步增大,且降解环的大小可反映酶活大小.因此,此法可以直观、清晰、准确地对具有几丁质酶活性的菌株进行筛选,在相关菌株的筛选中具有较大的潜在应用价值.【总页数】4页(P163-166)【作者】胡晓;张敏;刘彭强;邓秋蕾;舒凯【作者单位】四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014【正文语种】中文【中图分类】Q93-31【相关文献】1.产几丁质酶菌株 S68-CM5产酶条件优化研究 [J], 胡基华;曹旭;孟力强;陈静宇;姜威;刘宇帅;张淑梅;李晶2.一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化 [J], 苗飞;孟阳;王悦;袁春营;崔青曼3.产几丁质酶菌株的分离鉴定及产酶条件探究 [J], 左一萌;石晓玲;潘晓梅;王欢;尹永得;董雪滢;王超4.产低温几丁质酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化 [J], 陈立功;吴家葳;张庆芳;迟乃玉;王晓辉5.产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化 [J], 张奇;王一兵;申乃坤;姜明国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
几丁质降解菌的分离鉴定与产酶条件探究
山西农业科学2021，49（4）：420-424几丁质降解菌的分离鉴定与产酶条件探究王敏,辛二娜,王瑶,张天宝,郭继虎,杜慧玲（山西农业大学基础部，山西太谷030801）摘要:随着黄粉虫养殖规模的扩大，废弃物中含有大量的黄粉虫虫蜕，而虫蜕中含有不易降解的几丁质。
为缓解环境污染，实现黄粉虫养殖废弃物中虫蜕的资源化利用，以自然填埋黄粉虫虫蜕1a 的土壤为材料，采用透明圈法筛选几丁质降解菌（命名为Wn ），经16S rDNA 同源进化关系鉴定种属，最后通过单因素试验下的酶活性确定最优培养条件。
结果表明，Wn 为类芽孢杆菌属菌株，在以8g/L 的胶体几丁质为唯一碳源、装液量为1/3（50mL/150mL ）、pH 值为7.5、温度为30℃的发酵培养液中，培养96h 时的酶活性最大，为0.155U/mL 。
研究结果可为黄粉虫废物利用和生物防治奠定基础。
关键词:黄粉虫虫蜕；透明圈法；几丁质降解菌；最优培养条件中图分类号:S154.3文献标识码:A文章编号:1002-2481（2021）04-0420-05Isolation and Identification of Chitin-Degrading Bacterium and Exploration ofthe Optimal Culture Conditions for Enzyme ProductionWANG Min ，XIN Erna ，WANG Yao ，ZHANG Tianbao ，GUO Jihu ，DU Huiling（Department of Foundation ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：With the expansion of the breeding scale of Tenebrio molitor L.,there are a lot of Tenebrio molitor L.molts in the waste,and the molting contains chitin which is not easy to degrade.To alleviate the environmental pollution and realize the resource utilization of molting in Tenebrio molitor L.breeding waste,the chitin-degrading bacterium named Wn were isolated from the soil of natural landfill of Tenebrio molitor L.molts for one year by transparent circle method and identified by 16S rDNA homologous evolutionary relationship.The optimal culture conditions were determined by enzyme activity under single factor test.The results showed that Wn was Paenibacillus sp.strain.In the fermentation medium with 8g/L colloidal chitin as the sole carbon source,50mL of liquid volume,pH 7.5,30℃,the enzyme activity was the highest （0.155U /mL ）at 96h of culture.The results laid a foundation for the utilization of Tenebrio molitor L.waste and biological control.Key words ：Tenebrio molitor L.;transparent circle method;chitin-degrading bacterium;optimal culture conditions收稿日期:2021-01-15基金项目:山西省重点研发计划一般项目（201903D221050）；山西省重点研发计划项目（201703D221025-3）；山西省重点研发计划（重点）项目（201603D211202）作者简介:王敏（1995-），女，山西文水人，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。
几丁质酶的活性测定
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告摘要：几丁质酶是一种特殊的酶，在海洋生态系统中具有重要的生物学功能，因此对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
本文将实验室中先前筛选出的CK1-3菌株进行体外培养，通过测定其几丁质酶的活性进行筛选，同时优化产酶条件，最终得到高产几丁质酶的菌株。
接下来对于CK1-3菌株进行几丁质酶的纯化与鉴定，使用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤纯化CK1-3菌株的几丁质酶，测定其纯化比和比活力，同时采用SDS-PAGE和质谱分析进行鉴定。
关键词：几丁质酶；菌株筛选；纯化；鉴定；CK1-31. 研究背景随着人们对生物化学及海洋生态系统的研究深入，几丁质酶作为一种具有右旋螺旋结构的酶，逐渐成为研究重点。
它是一种特殊的酶，在海洋生态系统中，它可以释放出被几丁质包裹的有机物，为微生物提供能量和营养素。
同时，几丁质酶也被广泛应用于食品工业、纺织业等领域。
因此，对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
2. 研究目的本研究旨在筛选高产几丁质酶的菌株，同时对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化与鉴定。
3. 研究方法3.1 菌株的培养先前从海波中分离出的CK1-3菌株通过体外培养的方式进行増菌。
用含有几丁质的培养基进行培养，其成分为（每升）：几丁质4.0 g、柠檬酸0.5 g、胰蛋白酶1.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、FeSO4 0.002 g和微量元素液体1 mL。
3.2 几丁质酶的筛选对体外培养的CK1-3菌株进行几丁质酶的筛选，分别在不同的温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和培养时间（12、24、36、48、72 h）下测定几丁质酶的活性，最终确定其最佳产酶条件。
3.3 几丁质酶的纯化利用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化，测定纯化比和比活力。
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定谭海刚;李静;赵祥颖【摘要】几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶.在工业上,几丁质酶可用于制备功能性甲壳低聚糖.结合平板透明圈法和摇瓶发酵测酶活力的方法,从土壤中筛选到一株产几丁质酶的菌株L012,酶活力为0.75 IU/mL;采用离子色谱法对菌株L012产几丁质酶的酶解产物进行分析,初步确定产物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖以及聚合度小于10的寡糖.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2013(021)002【总页数】3页(P65-67)【关键词】几丁质;几丁质酶;几丁寡糖【作者】谭海刚;李静;赵祥颖【作者单位】山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013【正文语种】中文【中图分类】TS201.3几丁质酶专一性降解几丁质，水解得到的几丁寡糖、几丁二糖或N－乙酰葡萄糖胺在食品及药物方面有广泛的用途。
几丁质酶(chitinase，EC3.4.1.14)的酶源相当丰富，自从 Benecke［1］首次报道分离到几丁质酶产生菌以来，发现微生物中细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶。
不同来源的微生物的酶系有所不同，酶学性质差异较大。
一般微生物产几丁质酶的酶系含有外切几丁质酶、内切几丁质酶和几丁质二糖酶等。
本文采用平板透明圈法和摇瓶发酵相结合的方法从土壤等样品中筛选到一株产几丁质酶的菌株，并用离子色谱法对该菌株酶解产物进行了分析、鉴定。
1 材料与方法1.1 土样采自山东沿海等地区的土样。
1.2 主要试剂胶体几丁质(Colloidal chitin):按 Sun Chul Kang［2］的方法制备，细粉几丁质:济南海得贝公司，DNS试剂:参照文献［3］，磷酸缓冲液:参照文献［4］，其他试剂均为分析纯。
1.3 培养基1.3.1 富集培养基细粉几丁质 2.5 g/l，MgSO4·7H2O 0.5 g/l，K2HPO40.7 g/l，KH2PO40.3 g/l，FeSO4·7H2O 0.01 g/l，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。
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土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测
1 材料与方法
1.1 供试菌株
土壤中的根际菌。
1.2 培养基和试剂PDA 培养基; 产酶发酵培养基( g/ L ) :NH4NO3 3 g , KH2PO4 2 g , MgSO4 ·7H2O 0.6 g ,FeSO4·7H2O 0.1 g ,胶体几丁质5 g 粉状几丁质制备,pH:5～6 ;胶体几丁质PDA (g/ L) :马铃薯200g ,葡萄糖20 g ,琼脂17 g ,胶体几丁质2 %粉状几丁质制备;
1.3 几丁质酶活性测定
1.3.1 根际菌发酵液的制备将根际菌菌株接种到PDA 培养基平板(直径9 cm) 上,在光照恒温恒湿培养箱25 ℃、60 %湿度培养。
按根际菌菌株产酶发酵培养基组分配制液体培养基,以每瓶100 mL分装于250 mL 的摇瓶中,灭菌后备用。
把布满根际菌的平板用灭菌水浸泡3～5 min ,用棉签轻轻刮洗下菌体,用脱脂棉或4 层纱布过滤除去菌体,滤液即为孢子悬浮液。
根据血球记数板法进行计数,每瓶按6
10mL 孢子量接种5mL ,置于恒温摇床以180 r/ min、27～28 ℃培养一段时间。
将发酵液经4 层纱布过滤,滤液再以10 000r/ min 离心30min,弃去沉淀,得到灭菌的发酵上清液。
1.3.2 胶体几丁质PDA 平板透明圈实验胶体几丁质的制备按胶体几丁质PDA 组分制备培养基,并灭菌倒平板备用。
在平板的中央用直径0.5 cm 的打孔器打孔,无菌操作。
用灭菌枪头吸取40μl 灭菌的
发酵上清液(用孔径为0.20 μm 细菌滤器过滤灭菌) 加到孔中,用密封胶带封口,于恒温箱28 ℃保温,一段时间后开始观察透明圈情况胶体。
1.4 几丁质平板透明圈实验:观察可发现,根际菌发酵上清液在胶体几丁质平板上就可出现清晰的透明圈,透明圈的出现说明发酵液中存在催化分解几丁质的几丁质酶,通过胶体几丁质平板透明圈实验能够检测几丁质酶的存在。