第二章 基因工程的主要技术原理2

妙用RNaseH 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的 mRNA，并将其降解成许多小片断。 小片断正好成为DNA聚合酶的引物， 用来合成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用 DNA连接酶连成一整条DNA链。
3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物
mRNA cDNA 反转录酶 mRNA cDNA第一链 RNaseH
GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。
GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母 菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。
五、构建双杂交体系的穿梭质粒 1. 穿梭质粒（shuttle plasmid） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母 菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带已知的靶蛋白基因和携带 未知基因序列。
利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 ② mRNA的分离纯化 Column（柱） 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
4.应用双向杂交系统鉴定不同突变子与靶蛋白的反应能力。
5.在细胞内研究抗原和抗体的相互作用。
八、酵母双杂交系统存在的问题
1. 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细 胞核内，而许多蛋白质间的相互作用依赖于翻 译后的修饰如磷酸化和二硫键形成等，这些反 应在核内是无法进行的. 2. 假阳性，由于某些蛋白质本身具有转录激活作 用.
N：所需的重组载体数（克隆数）
ln (1-p) ln (1-99%) N= ln (1-f) = ln (1-f) = 4.61× G f
G N= 4.61× f G：Genome大小；f：fragment大小 例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。 ① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。 ① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。 ②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
转录表达
双杂交原理
X基因和Y基因 产物的相互结 合，导致 reporter gene表 达。
Reporter gene表 达就可说明X基 因产物与Y基因 产物能结合。
三、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型GAL4基因 使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。 此外还有其他营养缺陷。 如： SFY526; HF7c等菌株。 四、构建报告基因（reporter gene）
蛋白B
Active domain
DNA binding domain 蛋白A
4. 观察报告基因表达 通过效应基因是否被激活来检查：
在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。
（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 GAL4的DB domain与AD Domain也不 能靠近，所以仍然不能启动效应基因 的转录。 蛋白B 转录激活domain
（1）BD-plasmid 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在 GAL4的BD之后。 P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。
ADH：Alcohol dehydrogenase
核定位信号是GAL4 本身的一部分 筛选标志：TRP
（2）AD-plasmid 外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的 AD片断之后。 P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。 核定位信号是 SV40的T抗原 的序列 以在细菌中直接表达。 （3）包含库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
① 原理
DNA 聚合酶mRNA DNA 聚合酶
3’ mRNA 5’
3’ 5’
mRNA
cDNA第一链
去引物
DNA ligase
cDNA第二链 cDNA第一链
5.cDNA与载体连接：
在双链cDNA末端接上人工接头，即可与 载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 接上人工接头
五 .分子杂交技术 1、Southern blot 原理和方法: 双链DNA
放射自显影
限制性内切酶 消化 洗膜 杂交 转膜
电泳分离
NaOH变性
检测
NaOH或高温变性
标记的探针转基因样品检测, 等…
2、Northern blot 原理和方法: 是相对于Southern blot而命名的。 利用 DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理， 通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
测蛋白质样品。
主要用于基因在蛋白质水平上的表达研
究。
Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同:
(1) 检测的对象不同.
(2) 探针的性质不同,在Western blot中使
用的细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载61× 5 = 8.1 × 10 4 N= 4.61×逆转录出的DNA称cDNA。 3’ mRNA 5’ 5’ 引物 cDNA 反转录酶 3’ 2. cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进 行保存和扩增，称cDNA。单链RNA放射自显影
变性胶电泳分离
检测
洗膜
杂交
转膜
NaOH或高温变性
标记的探针
应用:
主要用于基因在转录水平上的表达研究。
基因时空特异性表达，及表达模式分析；
候选基因表达分析，有利于排除候选
基因，等…
CRG2(2) 物理图谱 5.8 kb
CRG3(0) 4.8 kb
CRG4(0)
RM5647(5) 6.4 kb
粘性末端
末端转移%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N=n : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA 占细胞整个mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4: 1-147aa 768-881aa Active domain N DNA binding domain C
结合 结合 激活转录 GAL4效应基因 上游激活序列（UAS） 转录机
实验发现：
转录表达
只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。 （2）目前常用的载体 载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb
六、酵母双杂交的实验过程
报告基因：HIS（合成组氨酸）
1. 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 2. 把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424） 3. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 4. 筛选观察
（1）存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培 养基上筛选双载体转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨 酸，菌体存活。 Trp-
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 粘性末端 ③ 同聚物加尾 末端转移酶 CCC 粘A时所 需要的克隆数目。
ln (1-pf: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数
2. 拆开 Domain 用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分 开，就丧失了激活效应基因的能力。
Active domain
DNA binding domain 结合 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
不能转录
3. 重组Domain 用重组DNA技术把这两个Domain分别与 两个不同的多肽连接。
用Oligo dT（或随机引物）作引物，合 成cDNA的第一链。 3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物 5’
② 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA 杂交分子中的mRNA。 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA 反转录酶 3’ mRNA cDNA第一链 碱 或RNaseH 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 5’ 3’
Leu-
（2）蛋白结合选择 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和 色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋 白B能相互作用的双载体转化子。
HisTrp-
Leu-
七、酵母双杂交系统的应用
1.鉴定已发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。 3.用于药物的筛选中。
③ cDNA第二链合成 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯 回来的双链发卡结构（机理不明），可成 为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚 合酶合成第二链DNA.。 5’ cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
④去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会 导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 3’ 5’
a
RiceGAAS预测
b
Pi36-1
NBS-LRR
Pi36-2