研究生分子生物学工作基础新基因研究路线2
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分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
分子生物学第六章--分子生物学操作技术二
• 目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱 变法，在基因序列中进行定点突变。
13
寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术
14
重叠延伸介导的定点诱变
大引物诱变法
15
五、其它研究基因表达技术
• 实时荧光定量PCR • Northern、Southern blotting • ……
16
第二节 基因功能研究策略
+
Double Strand RNA
Expression Down
35
RNAi广泛存在于自然界
• 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。
• 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的 早期阶段。
• 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工 具，RNAi也越来越为人们所重视。
9
选择性剪切的不同类型
RT-PCR检测5个拟南芥转 录调控因子基因的选择性剪切
10
三、原位杂交技术
• 原位杂交（ISH）是 用标记的核酸探针，经放射自显影或 非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核 酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体 原位杂交两大类。
• RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等） 标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存 在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过 放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出 定性定量分析。
• 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达 的现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双 链RNA而引起。
• 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。
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寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术
14
重叠延伸介导的定点诱变
大引物诱变法
15
五、其它研究基因表达技术
• 实时荧光定量PCR • Northern、Southern blotting • ……
16
第二节 基因功能研究策略
+
Double Strand RNA
Expression Down
35
RNAi广泛存在于自然界
• 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。
• 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的 早期阶段。
• 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工 具，RNAi也越来越为人们所重视。
9
选择性剪切的不同类型
RT-PCR检测5个拟南芥转 录调控因子基因的选择性剪切
10
三、原位杂交技术
• 原位杂交（ISH）是 用标记的核酸探针，经放射自显影或 非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核 酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体 原位杂交两大类。
• RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等） 标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存 在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过 放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出 定性定量分析。
• 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达 的现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双 链RNA而引起。
• 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。
研究生课程-分子生物学基本操作技术
线型DNA分子的 分离范围(Kb) 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
2）电泳缓冲液
• 常用三种缓冲液
– Tris-硼酸（TBE） – Tris-乙酸（TAE） – Tris-磷酸（TPE）
• TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果 好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高，容易使DNA沉淀
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增 PCR的基本原理
• PC第R反3轮应条扩件增
• PCR过程 • PCR的特点
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
PCR反应
• 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放 置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用 下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比， 与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度 的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过 电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。
聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩 增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量 的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千 百万倍。
• 一、PCR技术原理 • 二、PCR技术主要类型 • 三、PCR技术主要应用
一、PCR技术原理
PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
• 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小 分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许 多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学 界的高度重视。
第五章 分子生物学研究法-基因工程
3.目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌能从周围环境中吸收DNA时的生理状态 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力
第五章 分子生物学研究法
研究发现：
目的基因导入受体细胞
细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性，并可以利用异源启动子启动转录和蛋白 质合成。
第五章 分子生物学研究法
（1）转化方法 ① CaCl2转化法
目的基因导入受体细胞
感受态细胞的制备: 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞 得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞 (competent cells)。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
• 原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 cDNA人工合成获得目的基因
第五章 分子生物学研究法
目的基因的获取
目的基因的获取:
DNA片段
(RT)- PC库
化学合成法
第五章 分子生物学研究法
载体构建
2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接
- 染色体DNA不会复性，常常聚集形成网状结构,与变性 的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下去
目的基因导入受体细胞
1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌能从周围环境中吸收DNA时的生理状态 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力
第五章 分子生物学研究法
研究发现：
目的基因导入受体细胞
细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性，并可以利用异源启动子启动转录和蛋白 质合成。
第五章 分子生物学研究法
（1）转化方法 ① CaCl2转化法
目的基因导入受体细胞
感受态细胞的制备: 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞 得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞 (competent cells)。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
• 原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 cDNA人工合成获得目的基因
第五章 分子生物学研究法
目的基因的获取
目的基因的获取:
DNA片段
(RT)- PC库
化学合成法
第五章 分子生物学研究法
载体构建
2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接
- 染色体DNA不会复性，常常聚集形成网状结构,与变性 的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下去
分子生物学基础知识(两篇)2024
引言概述：分子生物学是一个关于生物体内分子结构、功能和相互作用的研究领域。
它涵盖了遗传物质DNA与RNA的复制、转录和翻译过程，以及蛋白质的合成、修饰和功能调控等方面。
在本文中，我们将继续探讨分子生物学的基础知识，为读者提供更深入的了解。
正文内容：一、DNA复制1.DNA复制的意义和基本原理2.DNA双螺旋结构的解开3.DNA复制酶的作用和分类4.模板链与新合成链的配对规则5.DNA复制的错误修复机制二、转录和RNA合成1.转录的基本概念和意义2.RNA聚合酶的作用和机制3.RNA合成的调控方式4.剪接和RNA后修饰5.转录的异质性和后转录调控三、翻译和蛋白质合成1.翻译的基本原理和意义2.tRNA的结构和功能3.翻译的起始、延伸和终止机制4.翻译后修饰和蛋白质的折叠5.翻译的调控途径和功能多样性四、蛋白质的修饰和功能调控1.蛋白质修饰的类型和作用2.磷酸化和酶的调控3.乙酰化和转录因子的激活4.泛素化和蛋白降解的调控5.蛋白质的定位和分子交互作用五、分子生物学技术1.聚合酶链式反应（PCR）和其应用2.荧光标记和共定位技术3.基因克隆和基因工程的原理4.单细胞测序和组学研究方法5.CRISPRCas9基因编辑技术和应用总结：分子生物学是现代生命科学领域中至关重要的一个分支，它研究了生物体内分子水平上的各种基本过程和调控机制。
本文逐一介绍了DNA复制、转录和RNA合成、翻译和蛋白质合成、蛋白质的修饰和功能调控以及分子生物学技术等方面的基础知识。
通过深入了解这些内容，读者将能更好地理解生物体的基本生命过程，并为进一步的研究和应用奠定扎实的基础。
引言概述：分子生物学是研究生物体内的分子结构、生物的化学组成、分子间相互作用以及分子在生物体内的功能和调控的学科。
对分子生物学基础知识的理解是理解生物学的基础，它涵盖了DNA的结构和功能、RNA的生物合成、基因表达调控、蛋白质合成等重要内容。
在本文中，我们将深入探讨分子生物学的基础知识。
研究生基因分子生物学课程2,2007
•反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕 •末端脱氧核苷酸转移酶
2020/12/2
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
2020/12/2
12
5’
3’
3’
5’
Mg2+
DNase I
5’
3’ 5’
3’ 5’
3’
3’
5’ 3’
5’
dATP
dCTP
大肠杆菌DNA聚合酶I
dGTP
(全酶〕
dTTP
5’
3’
Hale Waihona Puke 3’5’5’
3’
3’
5’
2020/12/2
在镁离子存在下，用低限量的DNA酶 I处理双链DNA，产生的切口
可作为大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕催化DNA合成的引物。合成
使反应在接近Km（使酶活性达最大值的一半时的底物浓度〕
的条件下进行。 3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及 离子浓度。
2020/12/2
1
（一〕DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有： •大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕 •大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕 •T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠 杆菌〕 •经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕 •热稳定D NA 依赖性 DNA聚合酶
9
外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”, 只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA 合成的准确性。 DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105 外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107 事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010
研究生生物基因操作流程
研究生生物基因操作流程Studying graduate level bioengineering involves a wide range of skills and knowledge that students must master in order to excel in this field. Graduate students in bioengineering must first gain a solid foundation in biology, chemistry, and engineering principles before delving into the intricacies of genetic manipulation. This strong foundation enables students to understand the fundamental concepts behind genetic engineering and allows them to apply these concepts in a practical setting.研究生生物工程需要掌握广泛的技能和知识，学生必须精通这些领域才能在这个领域取得成功。
生物工程的研究生必须首先在生物学、化学和工程原理方面建立扎实的基础，然后再深入研究遗传操纵的复杂性。
这种坚实的基础使学生能够理解遗传工程背后的基本概念，并让他们能够在实践中应用这些概念。
Once they have a solid understanding of the underlying principles, graduate students in bioengineering can begin to explore the various techniques used in genetic manipulation. This may include techniques such as cloning, gene editing, and gene therapy, each ofwhich has its own set of challenges and ethical considerations. By delving into these techniques, students gain valuable hands-on experience that prepares them for careers in research, academia, or industry.一旦他们对潜在原理有了扎实的了解，生物工程的研究生便可以开始探索遗传操纵中使用的各种技术。
研究生分子生物学工作基础新基因研究路线2-文档资料
2. A protein that is functional as a dimer. A mutation that removes the functional domain, but retains the dimerization domain would cause a dominate negative phenotype, because some fraction of protein dimers would be missing one of the functional domains. •
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
第五章-分子生物学研究法--DNA、RNA及蛋白质操作技术
应用TaqMan探针实时定量PCR技术
利用荧光染料SYBR Green Ⅰ可以检测PCR反应中 获得的全部双链DNA，但不能区分不同的双链 DNA。为了进一步确保荧光检测确实是靶DNA序 列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合 的荧光探针，如TaqMan探针。
这种探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中 间部位结合的单链DNA（50-150bp）。随着PCR 反应进行，这种探针结合到目的DNA序列上，并 且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除 而降解。被切下的荧光基团会在激发光下发出荧 光，荧光强度直接反映了扩增靶DNA的总量。
•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 •聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱 基对之间。 •凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小， 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色， 然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地 检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每 条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可以 被清晰地检测出来。
PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右
变变
90变95变
70变75变
变变
变变 40变60变
PCR指 数扩增时 循环次数 与DNA产 物数量的 比较。
PCR的基本原理
D9N4 A模板 温 DNA引物 度 7d2NTP （℃）TaqDNA聚合
55 酶
22
12
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条 单 链
变 性
第五章分子生物学基本研究法(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术可编辑全文
电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于 转化载体上常带有LacZ基因（大肠杆菌乳糖操 纵子中的一个基因），多用带有不同抗生素（常 用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素 等）的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化 细胞。
5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用 的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片 段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转 录产生的cDNA，就称为RT-PCR。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基 因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程 技术区别于其它技术的根本特征。
50℃~60℃，退火
引物与模板DNA相 结合
DNA合成（第三步）：
将反应混合物的温度上升到72℃左右保 温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并 沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新 生DNA互补链。
PCR扩增，72℃左右, 按 每 分钟1000个碱基对设计
5. 2. 1 核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质 与核酸相互作用的重要实验手段。
一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极。我们把这种 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫 做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳 分子本身所携带的净电荷数成正比，与 片段大小成反比。
5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用 的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片 段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转 录产生的cDNA，就称为RT-PCR。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基 因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程 技术区别于其它技术的根本特征。
50℃~60℃，退火
引物与模板DNA相 结合
DNA合成（第三步）：
将反应混合物的温度上升到72℃左右保 温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并 沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新 生DNA互补链。
PCR扩增，72℃左右, 按 每 分钟1000个碱基对设计
5. 2. 1 核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质 与核酸相互作用的重要实验手段。
一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极。我们把这种 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫 做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳 分子本身所携带的净电荷数成正比，与 片段大小成反比。
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(Global effects)
Degradation of mRNA (Sequence-specific effects)
Inhibition of protein synthesis Degradation of mRNAs
Endogenous SRC-1 RNAi
1
943 963
4365
SRC-1 mRNA
• Examples: 1. A mutation in a transcription factor that removes the activation domain, but still contains the DNA binding domain. This product can then block the wildtype transcription factor from binding the DNA site leading to reduced levels of gene activation.
Dominant negative mutant of a transcription factor
pol II
PP P
Inhibition of Expression
RNA interference (RNAi) Knockout
RNA INTERFERENCE (RNAi)
Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA". – Nobel Prize in Physiology and Medicine 2019
• Analysis of the Drosophila and C. elegans genomes reveals 3 types of RNase III enzymescontains a single RNase III signature motif and a dsRNA-binding domain (dsRBD; for example RNC_CAEEL ).
RNAi in Mammalian cells
> 30 base pair double-stranded RNA
Short interfering RNAs < 30 base pairs
PKRinactive
Cleavage
2’, 5’-ASinactive
RNAi
PKRactive
2’, 5’-ASactive
Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver, Craig C. Mello. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391: 806 – 811, 2019
2. A protein that is functional as a dimer. A mutation that removes the functional domain, but retains the dimerization domain would cause a dominate negative phenotype, because some fraction of protein dimers would be missing one of the functional domains. •
b-gal
Shang, Y., and Brown, M. Science 295: 2465-2468, 2019
-+ + +
Mechanisms Involved in RNAi
The Discovery of Dicer
• RNase III family members are among the few nucleases that show specificity for dsRNA.
Dicer Family
• Drosophila: Dicer • C. elegans: K12H4.8 • Arabidopsis: CARPEL FACTORY,
Dominant Negative
• A mutation whose gene product adversely affects the normal, wild-type gene product within the same cell. This usually occurs if the product can still interact with the same elements as the wild-type product, but block some aspect of its function.
5’ C C U C A G G G C A G A G A A C C A U C SU mT aTll interfering RNA (siRNA)
T T G G A G U C C C G U C U C U U G G U A G A 5’
SRC-1
AIB1
GRIP1
Lamin A Lamin C
2. Drosha, a Drosophila enzyme that contains two RNase III motifs and a dsRBD.
3. Homeless contains two RNase III signatures and an amino-terminal helicase domain (Drosophila CG4792 and CG6493; C. elegans K12H4.8)