第九章 转基因技术

外源基因的导入



方法：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒转 染法、基因枪法、磷酸钙共沉淀法、脂质体融合 法、激光介导法等 （一）鱼类基因转移中外源基因的导入方法 1、显微注射法 2、电穿孔法 3、精子载体法
4、基因枪法 5、逆转录病毒感染法 6、组织注射法 （二）虾类基因转移中外源基因的导入方 法 基因枪法

第四节 外源基因的检测
外源基因导入受体后，通常发生外源基因 进入到核中或没有进入核中。进入核中又 存在：游离于核染色体之外；部分同源序 列插入核DNA中，或外源基因全部插入核 DNA中。 外源基因是否整合、能否表达、以及表达 程度如何，都需要检测分析。

一、外源基因导入的检测
（一）DNA斑点杂交 将被检测标本的DNA点到支持膜上，烘烤 固定。以同位素或荧光标记的外源基因部 分片段作为探针，进行杂交检测。 （二）PCR阳性检测

二 外源基因的表达
（一）基因的表达及其调控机制 1 组织特异性表达 A, 相对短效的调控过程，由出现在表达细 胞内的调控因子结合到基因的调控DNA序 列上，激活基因表达。 B，长效调控，使细胞永久性地处于分化状 态，每一种细胞都可以长期维持和记忆它 所属的细胞类型的特征，只表达它应当表 达的基因

（4）双抗体RIA:将两种抗体中的一种结合 于固相支持物上，与未标记的靶蛋白进行 反应，经洗涤后再以过量的放射性标记的 第二抗体对结合于固相化抗体的靶蛋白进 行定量。
（四） 表达产物生物活性检测
当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时，可根据酶 的催化反应确定外源基因表达 与否和表达的程度。如淀粉酶、碱性磷酸酶、脂肪 酶等。

第二节 转基因技术的原理和方法
主要技术包括：外源基因的构建、外源基 因有效地导入生殖细胞或胚胎干细胞、外 源基因的表达与检测。 外源基因的构建： 启动子、目的基因、报告基因、转录终止 信号

启动子：



是DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合 物的区域，它和增强子（增强转录活性的结构）一 起构成了基因转录的顺式作用元件。 顺式作用元件和反式作用因子相互作用，协同调节 基因转录的精确性和灵活性。 分类：来自高等动物病毒基因的启动子（如SV40） 来自高等动物的启动子和增强子(如MT) 来自鱼类基因的启动子（如EF1）

外源DNA通常插入染色体的一个位点，在少数情 况下插入一个以上位点，甚至插入不同染色体。 机制：一般认为，外源DNA与其染色体上整合位 点之间，存在低度同源性；一种带有小卫星序列 的基因常会整合到染色体的卫星序列中。整合常 发生在匹配较差的序列之间的不正常交换。在外 源DNA及其染色体上的插入位点的结合部，常常 包含一段短的DNA序列（所谓填充序列），它明 显地既不来自外源DNA，也不来自染色体。

第三节 外源基因的整合、表达与遗 传
（一）、外源基因的命运 外源基因导入受精卵后经历了一系列复杂的生物学 过程，一般在胚胎发育早期的受体细胞内进行大 量的复制，复制以后经历部分降解、变构、多聚 化和逐渐与基因组整合。 注入线性外源DNA，无论携带克隆载体与否，均可 以线性单体、超环或松散环状分子以及以多聚体 形式存在，其中主要以多聚体形式存在，注入环 状分子则为发生变化。



（1）竞争性RIA：让待测样品中的未标记靶蛋白 与定量的放射性标记靶蛋白竞争抗体的结合位点， 通过对结合或未结合的靶蛋白的放射性活度进行 测定，确定靶蛋白的含量 （2）固定抗原RIA：将非标记的抗原结合到固相 支持物上，与放射性标记的抗体进行反应，通过 比较待测样品特异性结合的和与已知量的固相化 抗原结合的放射性活度来确定待测样品中的抗原 量 （3）固定抗体RIA:将抗体结合于固相支持物上， 通过测定结合于抗体上的放射性活度而确定待测 抗原的量

2、局限在生物种内个体间基因转移，血缘关 系较远的生物间传统杂交基因转移难度大， 转基因转移的基因不受生物体间亲缘关系 限制，打破自然繁殖的种间隔离，大大提 高动植物品种改良效率。

转基因技术为什么在水产动物应用较成功 1）鱼类的遗传可塑性强，如：缘缘杂交、 细胞核移植实验等证据 2）鱼贝和甲壳类怀卵量大、体外受精、体 外发育、胚胎操作简便和易于观察分析。
4、极少数情况下，可发现两个拷贝呈现头 对头或尾对尾的连接方式。 “循环排列线状”分子模型假说： 第一步，注入受精卵中的DNA分子迅速环 化； 第二步，环化分子被酶随机切开，形成一 系列循环排列的线状分子； 第三步，这些分子进行同源交换，形成相 同分子的串连连接的构型。

2 外源DNA整合到染色体上的机制
目的基因
1、概念：指编码特定蛋白质的结构基因， 它的表达能使转基因水产动物产生新的表 型。 2、选择目的基因的原则 （1）改变受体的代谢特征 （2）改变受体对环境适应能力

3 常用目的基因 （1）生长激素基因 （2）增强抗逆性的基因（如抗冻蛋白基因、 抗病性基因、珠蛋白基因） (3)报告基因：一种编码可被检测的蛋白或 酶的基因。（如CAT、neo、amp、 gal 、 luc 、GFP）
· 转基因技术发展应用

20世纪70年代，医药保健卫生方面，微生 物生产胰岛素、干扰素
1982年，大鼠生长素导入小鼠中，小鼠及 其子代生长体型较大 农业、畜牧业、水产养殖业转基因动植物 品系，培育出了一些高产、优质、抗逆性 强的转基因动、植物品系


（二）转基因技术在水产动物育种 中的应用
转基因技术与传统育种技术区别： 1、传统育种技术耗时长，转基因在短期内可 获得所要求的遗传性状。
•转基因在水产动物育种中的应用主要体现在： 第一，改良养殖性能，如加快生长，提高饵料利用 及抗逆性等。 第二，生产医药生物制品。如转基因鱼可高效表达 目的基因蛋白产物或合成相关代谢产物，成为高效 的“生物反应器”。 第三，培育新型观赏鱼或其他用途
转基因育种的另一个重要应用即是将抗菌 肽、溶菌酶和体液凝集素等抗病基因导入 对虾体内，是解决目前对虾病原数目不断 增加，抗逆性下降，种质资源退化的一个 有效途径。 转基因贝研究，利用电脉冲导入法将鱼生 长激素基因导入去膜的贻贝受精卵中，结 果表明阳性率达到41%。
（四）表达结构的构建和功能域转 移
一般都是在目的基因的两端各增加一个15kb的DNA片段，大概只含有启动子、增强 子和多聚腺苷酸化信号。 目的基因表达有时要依赖整合部位的染色 体环境 构建和转移完整的功能域，使被转移的基 因表达结构包含一切必要的调控元件。

三 整合基因的遗传
不完全按照孟德尔方式遗传 携带的外源基因可以通过性腺传递到子代 中，但子代鱼个体间外源基因的拷贝数存 在很大差异 转基因中嵌合体的存在，使得繁殖过程中 外源基因向子代的传递表现出无规律性。

二 外源基因整合的检测
提取样品基因组DNA，运用Southern杂交 技术，以导入的外源基因作为探针，与基 因组DNA做分子杂交，经放射自显影，就 可鉴定外源基因是否整合到基因组内。 （一）外源基因整合的判断 Southern杂交 （二）非整合形式的外源基因的判断

三、外源基因表达产物的检测

3、外源DNA整合时间和转基因嵌合 体产生
嵌合体动物是由至少两种基因组结构不相 同的细胞类型构成的动物个体。 转基因嵌合体的产生是由于基因整合时染 色体已复制，或者已整合的基因从一个子 染色体上丢失。

4、整合效率
外源DNA复制量与注入外源基因拷贝数在 一定范围内成正相关，与线性DNA分子片 段长短也有关。 外源DNA整合率与受体鱼种类、注入方式、 注入DNA的构型以及剂量有关

（三）同源重组
1、同源重组与基因锲入 同源重组：外源DNA可以通过同源交换整 合到染色体的特定位点，只是比随机整合 的频率低很多。 基因锲入：又称基因置转基因，使双链的 断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列 之外，转基因的结果是外源DNA取代内源 靶序列。

2.基因剔除
基因剔除是基因打靶的一种方法，类似于 同源重组技术，特指外源DNA与受体细胞 中同源基因组合并取代之。 条件性基因剔除：指在某一特定的细胞类 型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基 因的技术
第八章 转基因技术
第一节 概述

（一）转基因技术的发展
1、基因工程诞生：体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒， 转入大肠杆菌成功赋予宿主菌相应抗性。
2、基因工程：将一种或多种生物体的基因与载体在体外进行拼接重组，然后 转入另一种生物体内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
3、转基因技术：转基因的重组子构建技术、重组分子导入动植物体内的转化 技术、转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控性表达技术。

（3）免疫反应 （4）特异性表达产物的检测

3、Westhern印迹法 （1）总蛋白质的提取 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 （3）蛋白质印迹 （4）探针的制备 （5）杂交和检出

4. 固相放射性免疫测定（RIA）法
是一种定量测定外源表达蛋白的方法。具有很高的灵敏度，可检测1pg的靶蛋白。
（一）特异性mRNA的检测 1)外源基因与表达载体一起游离于染色体外 进行转录 2)外源基因整合到染色体上并进行转录 3)外源基因整合到染色体上后并不转录，而 表现为基因沉默

检测方法：Northern杂交（点杂交和印迹杂交）
（二）报告基因的酶法检测




报告基因的特点：其一，表达产物及其功能在未 转化的受体细胞中不存在；其二，报告基因的表 达产物便于检测 CAT, GUS, cA, DHFR 检测方法：活体内荧光素酶活性检测，将被检测 的组织材料放置于一小容器内，加入适量的组织 培养液体培养基、荧光素、ATP等。 体外荧光素酶活性检测，待检组织材料经破碎和 高速离心后，提取上清液，加入到含有适量Mg2+、 ATP和荧光素的缓冲液中，以荧光计测定荧光强 度