蛋白质相互作用技术研究的几种技术
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
预测蛋白的互作蛋白的方法
预测蛋白的互作蛋白的方法
预测蛋白的互作蛋白的方法主要有以下几种：
1. 免疫共沉淀技术：免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE 及Western blotting分析。
2. pull-down技术：用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
以上方法仅供参考，建议查阅专业书籍或文献以获取更多关于预测蛋白互作蛋白的更具体的信息。
证明三个蛋白互作的方法
证明三个蛋白互作的方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：在生物学和生物化学研究中，了解蛋白之间的相互作用对于理解生物体内的生物过程至关重要。
证明三个蛋白互作的方法通常涉及了多种实验手段和技术。
本文将针对证明三个蛋白互作的方法进行详细的介绍，希望能对相关研究者有所帮助。
证明三个蛋白互作的方法之一是利用蛋白质相互作用的生物物理实验技术。
生物物理实验技术主要包括质谱法、核磁共振法和X射线晶体学等。
这些方法可以通过测定蛋白的结构和相互作用界面，进而确定蛋白之间是否存在互作关系。
在证明三个蛋白互作时，可以利用这些技术来确定三个蛋白在三维空间中的位置关系，从而验证它们之间的相互作用关系。
证明三个蛋白互作的方法还可以通过基因工程技术来实现。
基因工程技术主要包括构建表达载体、转染细胞、CRISPR/Cas9基因组编辑等。
这些技术可以通过操纵蛋白的表达水平或突变蛋白的结构，来验证蛋白之间的互作关系。
在证明三个蛋白互作时，可以通过基因工程技术来构建表达三个蛋白的转染细胞株，从而验证它们是否存在互作关系。
第二篇示例：蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们在细胞的功能和结构中扮演着重要的角色。
在生物体内，蛋白质之间通过互作相互影响，调控着细胞的生理功能。
研究蛋白质的互作关系对于理解细胞内的生物学过程至关重要。
本文将介绍三种常用的方法来证明三个蛋白质之间的互作关系。
一、酵母双杂交技术酵母双杂交技术是研究蛋白质互作关系的经典方法之一。
该技术利用了真核生物酵母中的转录因子（酵母双杂交感受器）来检测蛋白质间的相互作用。
其原理是将感兴趣的蛋白质A与转录因子的结构域序列连接在一起，构建成融合蛋白质，当融合蛋白质A与蛋白质B相互作用时，会使转录因子激活，从而促使下游的报告基因表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断蛋白质A与蛋白质B之间是否存在互作关系。
二、质谱分析技术质谱分析技术是一种高通量的蛋白质互作分析方法。
通过质谱技术可以对蛋白质样品进行分析，确定蛋白质的氨基酸序列和翻译后修饰。
研究蛋白质相互作用的方法
研究蛋白质相互作用的方法
1. 酵母双杂交呀，这就像是给蛋白质牵红线，看它们能不能对上眼！比如说，我们研究那两个蛋白质，就把它们分别放到酵母里，看它们能不能相互吸引，哇，真的很神奇呢！
2. 免疫共沉淀那也是超厉害的哦！就像是从大部队里精准地捞出我们想要的那两个蛋白质小伙伴。
就像研究细胞里的那两个关键蛋白，通过这个方法把它们一块儿抓出来，看看它们的关系，你说有趣不有趣呀！
3. 亲和层析呀，不就是设个专门的陷阱让目标蛋白质掉进去嘛！举个例子，我们要找那个特定的蛋白质，就设计个跟它特别契合的柱子，让它乖乖进去，然后就能研究它啦，是不是超棒呀！
4. 荧光共振能量转移，哇塞，这简直就是在蛋白质之间观察神秘的能量传递呀！比如说观察那两个发着光的蛋白质，看它们之间能量怎么流动，那感觉真的太奇妙啦！
5. 表面等离子体共振呢，就像是给蛋白质的互动建了一个超级敏感的检测站呀！比如研究那两个蛋白结合的过程，细微的变化都能察觉到，牛不牛啊！
6. 噬菌体展示技术也很有意思呢，就像是让蛋白质在噬菌体这个舞台上展示自己。
比如我们想找和某个分子结合的蛋白质，通过噬菌体就能把它们找出来，多神奇呀！
7. 蛋白质微阵列，这不就是把一堆蛋白质摆出来让人一目了然嘛！像我们把各种蛋白质放在那上面，然后就能快速了解它们之间的关系啦，酷不酷！
8. 生物膜干涉技术呀，就像是在蛋白质的世界里放了一个精准的测量仪。
例如我们想知道那两个蛋白质结合的实时情况，用这个技术就能清楚看到，你说厉害不厉害！
我觉得这些方法各有各的独特之处，都为我们深入研究蛋白质相互作用提供了强大的工具，让我们能更好地理解蛋白质的奥秘！。
检测蛋白互作的方法
检测蛋白互作的方法有多种，其中包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀、GST-pull down实验等。
这些方法都可以用来研究蛋白之间的相互作用，并有助于进一步了解蛋白质的功能和机制。
1. 酵母双杂交技术：这是一种在酵母细胞中检测蛋白互作的方法，主要通过将两个蛋白的基因分别与报告基因的转录激活域融合，在两个蛋白相互作用时，报告基因就会被激活，从而得到蛋白互作的结果。
2. 免疫共沉淀：这是一种通过抗体和抗原之间的专一性作用来研究蛋白互作的方法。
将其中一个蛋白进行免疫沉淀后，与其互作的蛋白也会被沉淀下来，然后通过Western blot等技术检测到被沉淀的蛋白，从而确定两者之间的相互作用。
3. GST-pull down实验：这是一种体外检测蛋白互作的方法，通过将目标蛋白与谷胱甘肽亲和树脂结合，再与待检测的蛋白混合，如果两者之间有相互作用，目标蛋白就会与待检测蛋白结合并被吸附在树脂上，最后通过Western blot等技术检测到结合的蛋白，从而证明两者之间的相互作用。
蛋白质相互作用技术研究的几种技术
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bait
proteinX
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection tran s fo rm e d
yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理
GST-融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull down实验流程
（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经
（6） SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析.
四、双分子荧光互补技术( bimolecular fluorescence complementation , BIFC)
BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP） 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别 与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互 作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在 空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发 出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目 标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作 用有重要意义。
bait
XY prey
transcription machinery lac 2
-galactosidase
蛋白质和蛋白质相互作用的技术
蛋白质和蛋白质相互作用的技术
蛋白质是生命活动中不可或缺的重要成分，它们参与了细胞代谢、信号传导、免疫应答等多种生物学过程。
蛋白质相互作用则是指不同蛋白质之间的相互结合和互动，这种相互作用可以影响蛋白质的结构、功能和活性，进而影响细胞和生物体的生理过程。
在科学研究中，研究蛋白质相互作用的技术至关重要。
其中，蛋白质相互作用的技术主要包括免疫共沉淀、亲和纯化、酵母双杂交、质谱分析等。
免疫共沉淀是一种常用的蛋白质相互作用分析技术，它利用抗体将目标蛋白质与结合的蛋白质一起沉淀下来，再通过Western blot等方法检测蛋白质间的相互作用关系。
亲和纯化则是利用亲和柱或亲和标签来富集目标蛋白质及其结合蛋白质，通过洗脱和分析来研究它们之间的相互作用。
酵母双杂交则是通过将靶蛋白质与转录激活因子结合，来检测它们之间的相互作用。
质谱分析是一种高通量、准确度高的蛋白质相互作用分析技术，它可以用来鉴定蛋白质间的直接或间接相互作用。
这些技术各自有着特点和优势，可以用来研究不同类型的蛋白质相互作用，从而揭示细胞内各种生物学过程的机制。
通过深入了解蛋白质相互作用，我们可以更好地理解细胞信号传导、疾病发生机制等重要生物学问题，为药物开发和临床治疗提供理论基础。
总的来说，蛋白质相互作用的技术在生命科学领域具有重要的应用前景，它为我们深入了解细胞生物学过程、疾病机制以及药物研发提供了有力的工具和方法。
希望未来能够有更多的技术不断涌现，为蛋白质相互作用的研究提供更多可能。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法蛋白互作技术蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。
所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。
经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。
蛋白质互作（图片来源：百泰派克生物【biotech-pack】）1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B 也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。
但是也存在一定局限性。
酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白，但是假阳性高，免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证，不能发现新的未知蛋白。
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transfection
e x t r a c t p la s m id s
re-transformed yeast
X
Y
?
agar plate
positive yeast containing
bait plus predator!
th e fishing was good!
sl-iednedshoof w
-
• 酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的 DNA结合域(BD)， C端：113个氨基酸组成的转录 激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激 活序列(upstream activating sequence，UAS)结 合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转 录。
Y
does X bind with a protein?
to tal m R N A re v e rs etra n s c rip ta s e
cDNA y e a s t p l a s m i d e x p r e s s i o nection
activation domain
处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心
5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上， 用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 将菌体用溶菌酶处理，之后破碎细菌壁，最大转速 4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。 （6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 （7） 加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或质谱仪分析。
-
三、免疫共沉淀原理
• 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经 典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固 化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白， 那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。 再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者 间的相互作用。
• 组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表 达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的 蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白 （prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主 菌株。
-
F i s h i n g w i t h t h e y e a s t t w o - h y b r i d s y s t e m
bait
XY prey
transcription machinery lac 2
-galactosidase
X-gal
blue color
NH2
Gal4
BD
A
+
Gal4
NH2 AD B
COOH 共转化
Gal4
B AD
COOH
Gal4
BD
A
Promoter
Reporter
-
举例
酵 母 双 杂 交 基 本 过 程
bait
proteinX
cDNAforX
DNAb in d in g d o m a in transfection
tran s fo rm e d yeast
X
yeast plasmid expression vector
predator
unknow
tis s u e
b a it
predator
X
（4） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗 体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗 体与protein A琼脂糖珠偶连。
（5） 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖 珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟。
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二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验 (GST-pull down）原理
GST-融合蛋白 + 谷胱甘肽-琼脂糖球珠 X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
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GST pull down实验流程
（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经
Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新 方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理：
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分 开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4 （酵母 转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具 功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表 达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则 无法完成激活功能。
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三、免疫共沉淀原理
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免疫共沉淀实验流程
（1）将菌体用溶菌酶处理，冰上裂解30min,之后破碎细菌 壁，最大转速4℃离心30min,收集上清液。冰上裂解30min,
（2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加 1μg相应的抗体加入到细菌裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过 夜。
（3） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次3,000 rpm离心3 min。
（6） SDS-PAGE, Western blo- tting或质谱仪分析.
四、双分子荧光互补技术( bimolecular fluorescence complementation , BIFC)
BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP） 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别 与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互 作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在 空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发 出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目 标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作 用有重要意义。
蛋白质相互作用研究技术
汇报人: 布沙热木.阿布力孜 玛伊热.努热艾合买提 夏尤普.玉苏甫 阿布力米提.莫明
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常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交 谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pull down） 免疫共沉淀 双分子荧光互补技术(BIFC) 生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）技术
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一、细菌双杂交系统