不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA.
骨组织总RNA提取及反转录标准操作流程模板
骨组织总RNA提取及反转录标准操作流程模板一、仪器试剂Trizol 试剂三氯甲烧(4℃预冷)异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（超纯水处理水配置）(4℃预冷)DEPC处理水RNase free water (反转录试剂盒)1.5mL无酶EP管200uL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒(Takara RR036A)二、样品处理1.组织样品处理将骨组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1 ml Trizol 溶液，混匀，冰上放置10-15min使其充分裂解。
注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80℃保存。
研磨过程中注意保持样品低温状态。
三、总RNA提取(冰浴)1.每1ml Trizol（500ml）溶液加入200μL（100μL）三氯甲烷，立即盖上盖子，涡旋混匀15s，使水相和有机相充分接触，冰上静置10min。
2.4℃下，12000rpm离心15min，液体分为三层，RNA位于上层水相，移至新无酶EP管中(用20-200μL的枪吸取上清，吸上清时，EP管倾斜大约45度，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间白色层。
（取少不取多)。
3.加入与上清液等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(上下颠倒15-30次)，冰上静置10min。
4°C下，12,000rpm离心10min，可见羽毛状白色RNA沉淀，倒出上清。
4.1mL 75%乙醇洗涤两次(4°C 7500g离心5min，加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不可使用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）。
弃上清，保留沉淀，4℃下，12,000rpm离心1min，小枪头吸干。
注：RNA可与75%乙醇中4℃保存一周，-80°C保存一年。
5.超净台上管子倒置晾干10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
视沉淀量加入适10-20量DEPC水(15μL，10～20μL,10μL)溶解沉淀，使用Nano Drop测定RNA浓度。
不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA.
中国组织工程研究 第18卷 第51期 2014–12–10出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 10, 2014 Vol.18, No.51ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH8201www.CRTER.org孙志涛，男，1978年生，安徽省淮南市人，汉族，2013年广州中医药大学毕业，博士，主要从事脊柱、髋膝关节退行性变研究。
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.51.001 []中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)51-08201-05 稿件接受：2014-10-29Sun Zhi-tao, M.D., Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2014-10-29不同方法提取SD 大鼠膝关节软骨组织的总RNA孙志涛1，牛 维2，何升华1，林定坤2 (1深圳市中医院，广东省深圳市 518000；2广东省中医院骨三科，广东省广州市 510120)文章亮点：1 目前文献报道的软骨RNA 提取有多钟方法，常见的有Rneasy Lipid Tissue Kit 、RNAout 试剂盒和经典Trizol 法，国内文献报道多为经典Trizol 法。
作者在实验中发现该方法提取的RNA 并不能满足后续实验的需要，为了解决这个瓶颈，作者尝试了各种方法。
2 比较目前文献报道的常见3种不同方法提取的软骨组织RNA ，结果显示Rneasy Lipid Tissue Kit 法获得的总RNA 纯度高、完整性和稳定性好，并能成功反转录合成双链cDNA 。
关键词：组织构建；软骨组织构建；软骨；RNA 提取；大鼠；国家自然科学基金 主题词：软骨；RNA ；大鼠 基金资助：国家自然科学基金项目(81173285)摘要背景：目前文献报道的软骨RNA 提取有多钟方法，国内文献报道多为经典Trizol 法，在实验中发现该方法提取的RNA 并不能满足后续实验的需要。
一种从动物软骨组织提取rna的方法与流程
一种从动物软骨组织提取rna的方法与流程动物软骨组织提取RNA是一项重要的实验技术，它可以帮助我们了解RNA在生物体内的功能以及与疾病相关的变化。
下面我将介绍一种常用的提取RNA的方法和流程，希望能对你的研究有所帮助。
首先，我们需要准备动物的软骨组织样本。
可以选择小鼠、大鼠等实验动物作为研究对象，根据需要选择相应的软骨组织（如关节软骨、气管软骨等）。
收集样本时要注意保持样本的完整性和新鲜度。
第二步是样本的处理。
将收集到的软骨样本迅速放入离心管中，添加适量的缓冲液，如TRIzol试剂，用冰冻离心机将样本离心以去除其他组织的干扰。
随后，使用组织绞碎器或刀片将软骨组织完全破碎成非常细小的颗粒。
接下来，将细小的软骨碎片转移至新的离心管中，并添加适量的酚/氯仿试剂，充分混匀。
这一步的目的是将RNA与其他组织成分分离。
然后，用离心机将样本离心，以分离RNA与其他成分。
在离心的过程中，RNA会析出到上层的水相中。
将上层水相转移至新的离心管中，并添加异丙醇等沉淀剂，留置一段时间以沉淀RNA。
接下来，用离心机将样本离心以沉淀RNA。
沉淀后的RNA形成一个白色半透明的颗粒，底部为酚/氯仿相，上层为异丙醇相。
接下来是重要的洗涤步骤，首先用70％乙醇洗涤RNA沉淀颗粒，以去除污染物。
在洗涤的过程中，轻轻颠倒离心管以将RNA彻底洗涤。
最后，用离心机将样本离心，以去除洗涤过程中残留的乙醇。
将离心管倾斜，使用吸管吸除残留的乙醇即可。
提取RNA的方法和流程非常简单，但需要注意几个关键点。
首先，实验中所有操作必须在无RNase的环境下进行，避免RNase污染破坏RNA。
其次，在提取过程中要尽量避免样本的氧化和降解。
最后，提取的RNA可用于后续的实验，如逆转录PCR等。
总结起来，从动物软骨组织提取RNA的方法和流程如下：样本处理-酚/氯仿相分离-RNA沉淀-洗涤-去除乙醇。
希望这篇文章能够对你在RNA提取方面的研究提供一些指导和借鉴，祝你实验顺利！。
不同组织总rna提取
不同组织总rna提取
总RNA是一种包含所有转录本的RNA样品，对于许多生物学研究非常重要。
不同组织中的总RNA提取方法可能略有不同，以下是一些常见的总RNA提取方法：
1. 经典酚/氯仿法：该方法适用于多种组织，包括动物和植物组织。
它利用酚和氯仿的不同溶解度将RNA从DNA和蛋白质中提取出来。
它需要耗时且冗长的样品制备步骤，但可以获得高质量的RNA。
2. Trizol法：该方法是一种常用的RNA提取方法，适用于多种组织和细胞类型。
它使用一种酚-胍-氯仿混合物将RNA从细胞和组织中提取出来。
这种方法比经典酚/氯仿法更快，也可以获得高质量的RNA。
3. 氯化锂法：该方法适用于小型样品和细胞类型，例如酵母细胞。
它使用氯化锂和酒精的不同溶解度来提取RNA。
这种方法需要较短的制备时间，但可能会影响RNA的质量。
4. 柱式RNA提取法：该方法使用酚/氯仿或Trizol提取RNA，
并通过硅胶柱纯化步骤来去除杂质。
这种方法可以获得高质量的RNA，并且适用于各种组织类型。
总之，不同组织中的总RNA提取方法略有不同，但通常都可以使用上述方法之一。
选择合适的方法取决于实验的具体需求和样品类型。
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U6和let-7a作为定量检测miRNAs的内参在大鼠软骨中稳定性的比较
U6和let-7a作为定量检测miRNAs的内参在大鼠软骨中稳定性的比较易林;郭华;郭东贤;闵自信;袁莹;赵益童;韩燕;钟楠楠;孙健【摘要】目的比较U6和let-7a两种内参在RT-qPCR方法检测大鼠股骨头软骨样本microRNAs(miRNAs)的稳定性.方法取软骨生成过程的新生(D0)、断乳(D21)、性成熟(D42)3个时间节点的雌性近交系DA大鼠股骨头软骨,提取总RNA,用RT-qPCR方法分别在U6和let-7a两种内参体系下,检测miR-1、-25、-26a、-140、-146a、-150、-181a、-195、-223、-337等的表达,并与课题组前期获得的二代测序绝对定量结果进行比较,综合评价两种内参的稳定性.结果在D42样本中U6(P=0.045)、let-7a(P=0.0215)的相对值出现了显著性差异;在两种内参体系中miR-26a、-140、-223、-337的表达趋势相同,miR-1、-146a差异无统计学意义,miR-25、-150、-181a、-195都出现了显著性差异(P＜0.05).综合二代测序绝对定量结果比较,let-7a稳定性优于U6.结论 let-7a稳定性优于U6,更适合做软骨miRNA定量的内参.%Objective To evaluate the stability of U6 and let-7a as internal reference genes of miRNAs in RTqPCR by using femoral head samples of cartilage tissue from inbred DA rats.Methods Total RNA was extracted from femoral head cartilage tissues of female DA rats at three different time points,i.e.at birth (D0),ablactation (D21) and maturation (D42).The expressions of different miRNAs (miR-1,-25,-26a,-140,-146a,-150,-181a,-195,-223 and-337) were detected by RT-qPCR using U6 or let-7a as the internal reference.The two sets of miR expression were compared with the results from Solexa sequencing in our pioneer work to evaluate the stability of the two internal references.Results The relative values of U6(P =0.045) and let-7a (P =0.021 5) revealed significant difference in theD42 sample.Both in U6 and let-7a systems,miR-26a,-140,-223,and-337 showed a similar tendency in expression and quantification but miR-1 and-146a did not have significant differences.miR-25,-150,-181a and-195 differed significantly (P＜0.05).Comparison of absolute quantification results between the two generations' sequencing showed that let-7a is more stable than U6.Conclusion Let-7a is more suitable to be used as the internal reference gene in RT-qPCR for miRNAs in cartilage tissue.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(038)004【总页数】6页(P497-501,535)【关键词】软骨;内参;RT-qPCR;U6;Let-7a;microRNAs(miRNAs)【作者】易林;郭华;郭东贤;闵自信;袁莹;赵益童;韩燕;钟楠楠;孙健【作者单位】西安交通大学医学部附属红会医院急诊科,陕西西安 710054;西安交通大学医学部附属红会医院急诊科,陕西西安 710054;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西西安 710061;环境与疾病相关基因教育部重点实验室,陕西西安 710061【正文语种】中文【中图分类】R393microRNAs(miRNAs)作为一种重要的转录后调控方式和分子标记，参与了软骨细胞增殖与分化的每一个环节，在软骨组织的修复及再生过程中发挥重要作用，并与骨关节炎(osteoarthritis, OA)的发生、发展密切相关[1-2]。
不同组织总rna提取
不同组织总rna提取
本文介绍总RNA的提取方法，适用于不同的组织样本。
总RNA提取步骤如下：
1. 样品处理：将组织样品切碎并加入荷叶酸/酶混合液，破坏细胞结构，使总RNA易于提取。
2. 离心：将样品离心，得到上清液。
3. 加入异丙醇：将异丙醇加入样品中，使得RNA分子成为可见的粘稠团块，方便后续的提取。
4. 待沉淀：将样品放置在室温下，待RNA沉淀至底部。
5. 去除上清液：将上清液从样品中取出。
6. 加入乙醇：加入乙醇，使RNA固定在底部，最终形成白色固体。
7. 洗涤：用70%的乙醇洗涤RNA，去除杂质和其他污染物。
8. 干燥：将RNA干燥至完全失去水分。
9. 重溶解：将RNA重新溶解在板管中的去离子水中，可用于后续实验。
总RNA提取方法的步骤比较繁琐，但在实验过程中一定要注意严格控制样品温度和处理时间，以避免RNA的降解和污染。
大鼠膝关节骨性关节炎动物模型的两种实验方案
大鼠膝关节骨性关节炎动物模型的两种实验方案钱洁;邢雪松;梁军【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2014(033)011【摘要】通过前交叉韧带切断及膝关节制动两种实验方法,诱导大鼠膝关节发生骨性关节炎.将SD大鼠随机分为前交叉韧带切断组、膝关节制动组,分别进行前交叉韧带横断和伸膝位石膏固定.在处理后第3、6及8周处死大鼠,取膝关节股骨内髁关节软骨,测定各实验组膝关节软骨基质蛋白多糖、Ⅱ型胶原纤维及软骨细胞凋亡的病理变化.以HE染色法评定Mankin关节软骨病理评分,判断骨性关节炎分期.结果表明:大鼠前交叉韧带切断法及膝关节制动法均能建立骨性关节炎动物模型,但不同方法建立的骨性关节炎模型的病变特点及病理分期不尽相同.前交叉韧带切断模型组造模时间较长,实验6、8周分别为早期和中期骨性关节炎,基质流失是其首动因素;膝关节制动模型组造模时间较短,实验3、6和8周分别为早期、中期和晚期骨性关节炎,软骨细胞损伤和基质分解共同作用是其病理特点.【总页数】5页(P23-27)【作者】钱洁;邢雪松;梁军【作者单位】同济大学生命科学与技术学院,上海200092;高淳区医保中心,江苏南京211300;高淳区双塔医院,江苏南京211300【正文语种】中文【中图分类】R684.3【相关文献】1.从复方中药糖肾胶囊干预IR大鼠的研究浅谈实验动物模型及实验方法 [J], 闫小光;李怡2.应用两种不同建模方式构建子痫前期SD大鼠动物模型的实验研究 [J], 张晓丽;赵晓勇3.大鼠单纯胰腺移植动物模型两种术式研究 [J], 刘小南;王为忠;李开宗;陈彩平;陈冬利;罗兰4.两种诱发Fischer344大鼠卵巢癌动物模型建立方法的比较 [J], 邱丽楠;韩凤娟;范明明;吴效科;侯丽辉5.两种大鼠上颌快速扩弓实验动物模型的建立及比较 [J], 崔学路;邵玶;赵尔扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物组织总RNA提取实验操作
常规动物组织总RNA提取
(Trizol法)
实验操作流程
1摘要
本标准操作规程适用于一般动物组织的总RNA提取，一般情况下能得到高质量的总RNA。
2提取步骤
a)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成
粉末。
b)把样品粉末转入到装有TRIzol裂解液的2.0mL EP管中，（每mL裂解液可加50mg组
织样品）剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min。
c)10000rpm，4℃离心5min。
d)吸取上清液至新的2.0mL EP管中，每毫升裂解液加入200μL氯仿/异戊醇，剧烈颠倒
混匀。
e)10000rpm，4℃离心10min。
f)吸取上清液至新的1.5mL离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异
丙醇，轻轻颠倒混匀。
g)放入-20℃冰箱沉淀1h。
h)13600rpm，4℃离心20min。
i) 吸弃上清，加入1mL 75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。
j) 10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min。
k)用30-100μL DEPC水或者RNase-free水溶解沉淀。
3设备与试剂
3.1设备
3.2试剂。
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中国组织工程研究 第18卷 第51期 2014–12–10出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 10, 2014 Vol.18, No.51ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH8201www.CRTER.org孙志涛，男，1978年生，安徽省淮南市人，汉族，2013年广州中医药大学毕业，博士，主要从事脊柱、髋膝关节退行性变研究。
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.51.001 []中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)51-08201-05 稿件接受：2014-10-29Sun Zhi-tao, M.D., Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2014-10-29不同方法提取SD 大鼠膝关节软骨组织的总RNA孙志涛1，牛 维2，何升华1，林定坤2 (1深圳市中医院，广东省深圳市 518000；2广东省中医院骨三科，广东省广州市 510120)文章亮点：1 目前文献报道的软骨RNA 提取有多钟方法，常见的有Rneasy Lipid Tissue Kit 、RNAout 试剂盒和经典Trizol 法，国内文献报道多为经典Trizol 法。
作者在实验中发现该方法提取的RNA 并不能满足后续实验的需要，为了解决这个瓶颈，作者尝试了各种方法。
2 比较目前文献报道的常见3种不同方法提取的软骨组织RNA ，结果显示Rneasy Lipid Tissue Kit 法获得的总RNA 纯度高、完整性和稳定性好，并能成功反转录合成双链cDNA 。
关键词：组织构建；软骨组织构建；软骨；RNA 提取；大鼠；国家自然科学基金 主题词：软骨；RNA ；大鼠 基金资助：国家自然科学基金项目(81173285)摘要背景：目前文献报道的软骨RNA 提取有多钟方法，国内文献报道多为经典Trizol 法，在实验中发现该方法提取的RNA 并不能满足后续实验的需要。
目的：探索不同方法提取SD 大鼠软骨组织总RNA 的区别。
方法：选取3月龄SD 大鼠9只，分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit 、RNAout 试剂盒和经典Trizol 法对软骨组织进行总RNA 提取，并通过RNA 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性，以探寻软骨总RNA 最佳提取方案。
结果与结论：Trizol 法提取的RNA A 260/A 280值为1.58，说明纯度不高；RNAout 法提取的RNA ，由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原，也不能满足后续实验的需要；RNeasy ® Mini Kit 法和肝(Trizol)法提取RNA 的A 260/A 280值分别为2.00和1.98，说明提取的总RNA 或核酸的纯度高。
RNA 的完整性电泳结果显示，RNeasy ® Mini Kit 法、RNAout 法和肝(Trizol)法可见28 s 、18 s 及5 s 条带，而Trizol 法未见任何条带，RNAout 法28 s 和18 s 条带不清楚。
结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit 法获得的总RNA 纯度高、完整性和稳定性好，并能成功反转录合成双链cDNA ，而RNAout 试剂盒和经典Trizol 法获得的总RNA 不能满足后续实验需要。
孙志涛，牛维，何升华，林定坤.不同方法提取SD 大鼠膝关节软骨组织的总RNA [J].中国组织工程研究，2014，18(51):8201-8205.Different methods to extract total RNA from the knee cartilage tissue of Sprague-Dawley ratsSun Zhi-tao 1, Niu Wei 2, He Sheng-hua 1, Lin Ding-kun 2 (1Shenzhen Hospital of Traditional ChineseMedicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China; 2Third Department of Orthopedics, Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Currently, there are many methods to extract cartilage RNA reported in the literature, and classic Trizol method has been mostly reported in China. However, it is discovered that RNA extracted by the Trizol method cannot meet the needs of the follow-up experiments.OBJECTIVE: To explore the difference of different methods to extract total RNA from the cartilage tissues of Sprague-Dawley rats.METHODS: Nine Sprague-Dawley rats of 3 months old were selected to extract total RNA respectively byRneasy Lipid Tissue Kit, RNAout kit and classic Trizol method. Agarose gel electrophoresis was used to detect RNA integrity in order to explore the best extraction scheme of total RNA.RESULTS AND CONCLUSION: When Trizol method was used to extract RNA, the A 260/A 280 value was 1.58, indicating that the purity was not high. Due to a large number of proteoglycan and collagen in the cartilage, RNA extracted using RNAout method cannot meet the needs of the follow-up study. When RNeasy® Mini Kit and liver method (Trizol) were used to extract RNA, the A 260/A 280 values were 2.00 and 1.98, respectively, indicating that the extracted total RNA or nucleic acid had high purity. The RNA electrophoresis results showed that using RNeasy ®Mini Kit, RNAout and liver method (Trizol), 18 s, 28 s and 5 s stripes were visible; but there was no stripe using Trizol method. For RNAout method, 28 s and 18 s stripes were unclear. These results show that thetotal RNA obtained by the Rneasy Lipid Tissue Kit has the high purity, integrity and stability, and can successfully synthesize double-stranded cDNA by reverse transcriptase, but RNAout kit and classic Trizol methods cannot meet the need of subsequent experiments.Subject headings: cartilage; RNA; ratsFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81173285Sun ZT, Niu W, He SH, Lin DK. Different methods to extract total RNA from the knee cartilage tissue of Sprague-Dawley rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(51):8201-8205.0 引言 Introduction聚合酶链反应(PCR)技术是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法，自从20世纪80年代，Kary Mullis发明了该技术，便广泛应用于分子生物学研究中，以便在分子水平上阐明细胞活动的规律，揭示生命的本质。
高质量总RNA的提取是该技术有效开展的必要前提。
总RNA的抽提方法有多种，目前实验室常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法，Trizol是使用最广泛的RNA抽提专用试剂，它可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质和细胞核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整[1]。
随着实验要求的提高，为了从某些特殊组织中获取高质量总RNA，RNA抽提试剂盒应运而生，为实验研究提供了更大的方便。
软骨作为研究关节相关疾病的重要组织之一，其总RNA的有效提取对后续实验的进行起到关键性的作用，由于软骨的细胞含量低，且其细胞基质中含有大量的蛋白聚糖，提取RNA时，这种多糖的凝胶状沉淀与RNA相混[2]，使得RNA很容易随着多糖一起被去除，降低RNA的提取率[3]。