分子生物学研究方法-9
分子生物学的研究方法
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应用：生物信息学、药物筛选、环境监测、食品 安全等领域。
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优势：高灵敏度、高特异性、高通量、低成本等。
分子生物学研究 的应用领域
疾病诊断和治疗
靶向治疗：针对特定基因或蛋 白质的药物设计，提高治疗效 果和减少副作用
基因检测：通过检测基因突变， 预测疾病风险和诊断遗传性疾 病
免疫疗法：利用免疫系统攻击 肿瘤细胞，已成功应用于多种
个体化用药：基 于分子生物学研 究，实现个体化 用药，提高治疗 效果并降低副作
用。
生物进化研究
分子生物学研究方法在生物进化研 究中的应用
分子生物学研究方法在生物多样性 研究中的应用
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分子生物学研究方法在物种起源和 演化方面的应用
分子生物学研究方法在古生物研究 中的应用
基因表达分析
基因表达谱分析：通过高通量测序技术，对特定组织或细胞中的基因表达情况进行全 面检测和比较，了解基因的表达差异和调控机制。
实时定量PCR：通过荧光染料或探针标记的特异引物，对特定基因进行实时荧光检 测，实现对基因表达的定量分析。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）：通过与特定抗体结合的染色质片段，检测与DNA结 合的蛋白质，了解基因转录调控过程中的蛋白质相互作用。
跨学科研究的融合和创新
分子生物学与其他学科 的交叉融合，如物理学、 化学、工程学等，为研 究提供新的视角和工具。
创新的研究方法和技术在 分子生物学中的应用，如 人工智能、基因编辑等， 为解决复杂问题提供更多 可能性。
跨学科研究的融合和创 新有助于打破学科壁垒， 促进知识交流和成果转 化。
未来发展方向：加强跨 学科合作，推动技术创 新，拓展分子生物学的 研究领域和应用范围。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
分子生物学-9_真题无答案
分子生物学-9(总分100, 做题时间90分钟)选择题1.比较DNA聚合酶和RNA聚合酶，叙述正确的是：SSS_SINGLE_SELA RNA聚合酶以dNTP作为聚合反应的原料B DNA聚合酶以RNA作模板合成DNAC 两种酶都需要RNA引物D 两种酶催化新链的延伸方向都是5"→3"2.大肠杆菌中参与转录终止调控的是：SSS_SINGLE_SELA TATA boxB ρ因子C snoRNAD RNase P3.控制基因产物数量的最关键的步骤是：SSS_SINGLE_SELA 复制的终止B 可变剪接C 翻译的调控D 转录的起始4.利福平是RNA合成起始的抑制剂，这是由于利福平能够与E.coil的RNA聚合酶中的______亚基结合。
SSS_SINGLE_SELA .αB .β"C .βD .σ5.Pribnow盒属于：SSS_SINGLE_SELA 绝缘子B 启动子C 终止子D 增强子6.既可利用上游启动子，又可利用下游启动子的RNA聚合酶是：SSS_SINGLE_SELA RNA聚合酶ⅠB RNA聚合酶ⅡC RNA聚合酶ⅢD RNA聚合酶Ⅳ7.真核生物细胞核中的RNA聚合酶Ⅱ的特异性抑制剂是：SSS_SINGLE_SELA α-鹅膏蕈碱B 放线菌素DC 利福霉素D 嘌呤霉索8.原核细胞信使RNA含有几个其功能所必需的特征区段，它们是：SSS_SINGLE_SELA 启动子，SD序列，起始密码子，终止密码子，茎-环结构B 启动子，转录起始位点，前导序列，由顺反子间区序列隔开的SD序列和ORF，尾部序列，茎-环结构C 转录起始位点，前导序列，由顺反子间区序列隔开的SD序列和ORF，尾部序列D 转录起始位点，前导序列，由顺反子间区序列隔开的SD序列和ORF，终止子9.•**的RNA聚合酶σ因子有不同的形式，其中______参与绝大多数基因的转录。
A.σ70• B.σ32• C.σS• D.σFSSS_SIMPLE_SINA B C D10.关于放线菌素D叙述正确的是：SSS_SINGLE_SELA 放线菌素D与利福平一样都是临床上有效的抗菌药B 放线菌素D能抑制DNA的复制C 放线菌素D完全抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性D 放线菌素D能插入到DNA上的GC碱基对之间11.在正常的生长条件下，某一细菌基因的启动子-10序列由TCGACT突变为TATACT，由此而引起该基因转录水平的变化为：SSS_SINGLE_SELA 该基因的转录增加B 该基因的转录减少C 该基因的转录不能正常进行D 该基因的转录没有变化12.原核基因启动子的启动频率与______有关。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学研究方法习题天津农学院
分子生物学研究方法习题天津农学院1.限制性内切酶可对（A）A.双链DNA的特异部位进行切割B.双链DNA的任意部位进行切割C.单链DNA的特异部位进行切割D.mRNA的特异部位进行切割2.多数限制性核算内切酶切割后的DNA末端为（D）A.平头末端B. 粘性末端C. 缺口末端D. 3’末端突出3.Southern印迹的DNA探针（C）杂交A.只与完全相同的片段B. 可与任何含有相同序列的DNA片段C. 可与任何含有互补序列的DNA片段D. 可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段4. Southern杂交技术通常被用于研究（D）A．蛋白质与DNA的相互作用 B. DNA与RNA的相互作用C. 蛋白质与蛋白质的相互作用D. DNA与DNA的相互作用5. 有关反转录的正确叙述是（B）A. 反转录反应不需要引物B. 反转录后的产物是cDNAC. 反转录的模板可以是RNA，也可以是DNAD. 合成链的方向是3′→5′6.cDNA的最正确的说法是（A ）A. 同mRNA互补的单链DNAB. 同mRNA互补的双链DNAC. 以mRNA为模板合成的双链DNAD. 以上都正确7. 催化PCR的酶是（C ）A. RNA聚合酶B.DNA聚合酶C. Taq DNA聚合酶D. 反转录酶8. PCR反应主要有（变性）、（退火）、（延伸）三个步骤。
9. 酵母双杂交体系被用来研究（A ）A.蛋白质的相互作用B. 基因的表达调控C.哺乳动物功能基因的表型分析D. 酵母细胞的功能基因10. 免疫沉淀分一般用于分离（ C ）A. DNAB. RNAC. 蛋白质D. 脂类11. 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），是用于体外研究（A）相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术A. DNA与蛋白质B. DNA与DNAC.蛋白质与蛋白质D.RNA与DNA12. 基因芯片（DNA chip）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在（A）水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。
分子生物学复习7-9
第七章基因的表达与调控（上）——原核基因表达调控模式（一）基本概念1．基因表达：细胞在生命过程中，把蕴藏在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成为蛋白质或功能RNA分子的过程称为基因表达。
2．基因表达调控：围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都统称为基因表达调控。
rRNA或tRNA的基因经转录和转录后加工产生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA 的基因表达，因为rRNA或tRNA就具有在蛋白质翻译方面的功能。
3．组成型表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。
如ＤＮＡ聚合酶，ＲＮＡ聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质的表达。
管家基因：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。
管家基因无论表达水平高低，较少受到环境因素的影响。
在基因表达研究中，常作为对照基因适应型表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。
应环境条件变化基因表达水平增高或从无到有的现象称为诱导，这类基因被称为可诱导的基因；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低或变为不表达的现象称为阻遏，相应的基因被称为可阻遏的基因。
4．结构基因：编码蛋白质或功能性RNA的任何基因。
所编码的蛋白质主要是组成细胞和组织基本成分的结构蛋白、具有催化活性的酶和调节蛋白等。
原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。
结构基因簇由单一启动子共同调控。
调节基因：参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。
①调节基因编码的调节物质通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。
②调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式（启动或增强基因表达活性调节靶基因，也能以负调控的方式（关闭或降低基因表达活性）调节靶基因。
操纵子：由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因的转录受操纵基因的控制。
（二）原核基因调控的分类和主要特点一、原核生物的基因调控特点：（1）基因调控主要发生在转录水平上，形式主要是操纵子调控.（2）有时也从DNA水平对基因表达进行调控，实质是基因重排。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
它的研究方法多种多样，下面我们将通过一些例题来深入理解这些方法，并对相关知识点进行总结。
一、核酸提取与纯化核酸包括 DNA 和 RNA，是分子生物学研究的重要对象。
提取和纯化高质量的核酸是后续实验的基础。
例题：从植物叶片中提取总 DNA，需要经过哪些步骤？知识点：1、破碎细胞：使用机械研磨、酶解法等破坏细胞壁和细胞膜，释放出核酸。
2、去除杂质：通过加入蛋白酶 K 去除蛋白质，用酚/氯仿抽提去除酚类、多糖等杂质。
3、沉淀核酸：常用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，离心后获得核酸沉淀。
4、洗涤和溶解：用 70%乙醇洗涤沉淀去除盐分，干燥后用适当的缓冲液溶解。
二、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术。
例题：设计一对引物用于扩增某基因的特定片段，需要考虑哪些因素？知识点：1、引物长度：通常为 18 25 个核苷酸。
2、碱基组成：G ＋ C 含量在 40% 60%之间，避免形成稳定的二级结构。
3、特异性：引物要与目的基因特异性结合，避免与其他序列有过多的同源性。
4、退火温度：根据引物的碱基组成计算退火温度，以保证扩增的特异性和效率。
PCR 的基本步骤包括：1、变性：高温使双链 DNA 解离为单链。
2、退火：降低温度，引物与单链 DNA 结合。
3、延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物 3'端开始合成新的DNA 链。
三、基因克隆基因克隆是将目的基因插入到载体中，导入宿主细胞进行复制和表达。
例题：简述构建重组质粒的过程。
知识点：1、目的基因获取：可以通过 PCR 扩增、从基因文库中筛选等方法获得。
2、载体选择：常见的载体有质粒、噬菌体等，要根据实验需求选择合适的载体。
3、酶切和连接：用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来。
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关键步骤
转膜 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程.将 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程. 核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将 核酸点到膜上. 核酸点到膜上.是核酸杂交过程中的主要步 骤之一. 骤之一.
探针标记
标记方法:缺口平移,末端标记, 标记方法:缺口平移,末端标记,随机引物延 聚合酶链反应等. 伸,聚合酶链反应等. 核酸探针的种类:DNA探针 cDNA探针 RNA探 探针, 探针, 核酸探针的种类:DNA探针,cDNA探针,RNA探 针,寡核酸探针. 寡核酸探针. 选择标记方法: 选择标记方法:一般认为放射性探针比非放射 性探针的灵敏度高.在检测单拷贝基因序列时, 性探针的灵敏度高.在检测单拷贝基因序列时,应 选用标记效率高,显示灵敏的探针标记方法. 选用标记效率高,显示灵敏的探针标记方法. 在对灵敏要求不高时, 在对灵敏要求不高时,可采用生物素探针技术
点杂交( 点杂交(Dot blot) )
将被检测标本点到膜上,烘烤固定.这种方法耗时短, 将被检测标本点到膜上,烘烤固定.这种方法耗时短, 可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品. 可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品.为使点样 准确方便,市售有多种多管吸印仪(manifolds),如 ),如 准确方便,市售有多种多管吸印仪( ), Minifold I和II,Bio-Dot (Bio–Rad )和Hybri–Dot,它们有许 和 , 和 它们有许 多孔,样品加到孔中, 多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭 缝状,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本, 缝状,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可 以进行杂交. 以进行杂交.
分子生物学研究方法
重组DNA技术发展史上的重大事件 一, 重组 技术发展史上的重大事件
三大理论基础:
1. 40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不 是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题; 2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决 了基因的自我复制和世代交替问题; 3. 50年代末至60年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地 破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达.
70年代末期到80 年代早期, 70 年代末期到80年代早期 , 分子生物学技术有了突破 年代末期到 80年代早期 性进展,限制性内切酶,载体系统的发展和应用. 性进展,限制性内切酶,载体系统的发展和应用. 固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生, 固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生 , 现在可常规 制 备 18 ～ 100 个 碱 基 的 寡 核 苷 酸 探 针 . 应 用 限 制 酶 和 Southern印迹技术, 用数微克DNA就可分析特异基因, DNA就可分析特异基因 Southern 印迹技术,用数微克 DNA 就可分析特异基因 , 大 印迹技术 大提高了杂交水平和可信度. 大提高了杂交水平和可信度.
由于DNA一般都以双链形式存在, 由于DNA一般都以双链形式存在,因此在 DNA一般都以双链形式存在 进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成 进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成 DNA 为单链,这一过程称为变性, 为单链,这一过程称为变性,一般通过加热 或提高pH值来实现. 或提高pH值来实现. pH值来实现
菌落原位杂交( 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization) ) 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移 到硝酸纤维素滤膜上, 到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落 裂菌以释出DNA.将DNA烘干固定于膜上 . 裂菌以释出 烘干固定于膜上 标记的探针杂交, 标记的探针杂交 与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌 落杂交信号,并与平板上的菌落对位. 落杂交信号,并与平板上的菌落对位.
Northern印迹杂交( blot) Northern印迹杂交(Northern blot) 印迹杂交
将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法. RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法. 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法 DNA印迹技术由Southern 1975年创建 称为Southern 年创建, Southern印迹 DNA 印迹技术由Southern于 1975 年创建 , 称为 Southern 印迹 印迹技术由 Southern于 技术.RNA印迹技术正好与DNA相对应 故被趣称为Northern 印迹技术正好与DNA相对应, 技术.RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被趣称为Northern 印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot. blot. Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印 方法类似, 只是在进样前用甲基氧化汞, 方法类似 , 只是在进样前用甲基氧化汞 , 乙二醛或甲醛使 RNA变性 , 而不用NaOH 因为它会水解RNA NaOH, RNA的 - 羟基基团. RNA 变性, 而不用 NaOH , 因为它会水解 RNA 的 2'-羟基基团 . 变性 RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保 RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保 持其单链状态. 持其单链状态. 不同之处: 不同之处:没有酶切
核酸杂交反应首先经过凝胶电泳分离的DNA或RNA 分子,然后通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶 中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的. 常用的滤膜有尼龙滤膜,硝酸纤维素滤膜和二乙氨 基乙基纤维素滤膜(DEAE)等.
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交. 核酸杂交也称印迹杂交.
基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段. 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记 号的载体分子上,形成重组DNA分子. 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)并与之一起 增殖. 4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞, 并筛选出已经得到扩增的目的基因. 5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景 下实现功能表达,产生出所需物质.
在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)-ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外 光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的 条带.
2. 核酸的分子杂交技术
核酸杂交技术从Hall 等 1961年的工作开 核酸杂交技术从 Hall等 1961 年的工作开 Hall 始的, 探针与靶序列在溶液中杂交, 始的 , 探针与靶序列在溶液中杂交 , 通过平 衡密度梯度离心分离杂交体. 该法很慢, 衡密度梯度离心分离杂交体 . 该法很慢 , 费 力且不精确, 力且不精确 , 但它开拓了核酸杂交技术的研 究. 60年代中期 Nygaard 60 年代中期Nygaard 等的研究为应用标 年代中期 DNA或 RNA探针检测固定在硝酸纤维素 NC) 探针检测固定在硝酸纤维素( 记 DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素 ( NC ) 膜上的DNA序列奠定了基础. 膜上的DNA序列奠定了基础. DNA序列奠定了基础
Southern印迹杂交( blot) Southern印迹杂交( Southern blot) 印迹杂交
是研究DNA图谱的基本技术, DNA图谱的基本技术 Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术,在 遗传诊断DNA图谱分析,特定基因组的分析及PCR产 遗传诊断DNA图谱分析,特定基因组的分析及PCR产 DNA图谱分析 PCR 物分析等方面有重要价值. 物分析等方面有重要价值.
二, 基因操作的主要技术原理
1. 核酸的凝胶电泳(Agarose) 2. 核酸的分子杂交技术 3. 细菌的转化 4. DNA序列分析 5. 基因的定点诱变(site-directed mutagenesis) 6. 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究
1. 核酸的凝胶电泳
将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极 移动.某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度 成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的摩擦系数成反 比(分子大小,极性,介质的粘度系数等). 在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团 磷酸基团是离子化的,所以,DNA和 磷酸基团 RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions).将DNA,RNA放到电 场中,它就会由负极→正极移动 杂交的方法:
菌落原位杂交(Colony in situ hybridization) 菌落原位杂交( ) 点杂交( 点杂交(Dot blot) ) Southern印迹杂交( Southern印迹杂交( Southern blot ) 印迹杂交 Northern印迹杂交(Northern blot) 印迹杂交( 印迹杂交 ) 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)等. 组织原位杂交( )
1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠; 1983 获得第一例转基因植物. 1994第一批基因工程西红柿在美国上市. 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊. 2003年人类基因组计划完成,中国1%,
基因工程中常见的名词: 遗传工程--genetic engineering 基因操作--gone manipulation 基因克隆--gone cloning 重组DNA技术--recombinant DNA technology 分子克隆--molecular cloning.
三大技术支持
1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了限制性核酸内切酶. H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得