X射线晶体衍射技术应用于蛋白质晶体结构检测
常见的蛋白质结构解析方法
常见的蛋白质结构解析方法蛋白质是生物体中最基本的功能分子之一，其结构与功能密切相关。
了解蛋白质的结构可以揭示其功能，并为药物设计、生物工程等领域提供重要参考。
下面将介绍一些常见的蛋白质结构解析方法。
一、X射线晶体学X射线晶体学是最常用的蛋白质结构解析方法之一。
该方法利用蛋白质晶体对X射线的衍射现象进行分析，从而得到蛋白质的高分辨率结构。
X射线晶体学需要先获得蛋白质的结晶样品，然后通过冷冻技术将样品冷冻到液氮温度下。
接下来，将样品置于X射线束中，通过测量X射线的衍射图样，利用数学方法进行模型构建和优化，最终确定蛋白质的三维结构。
二、核磁共振核磁共振（NMR）是一种利用原子核的磁性性质来解析蛋白质结构的方法。
在NMR实验中，蛋白质溶液会被置于强磁场中，并通过给予一系列的脉冲序列来激发原子核的共振信号。
通过测量这些信号的频率和强度，可以获得蛋白质的二维或三维结构信息。
与X射线晶体学相比，NMR可以在溶液中进行，因此可以研究蛋白质的构象动力学和相互作用等方面。
三、电子显微镜电子显微镜（EM）是一种利用电子束与蛋白质样品相互作用来解析其结构的方法。
与传统的光学显微镜不同，电子显微镜使用的是电子束，具有更高的分辨率。
在EM实验中，蛋白质样品被冷冻或固定在网格上，然后用电子束照射样品。
通过收集和处理电子显微镜图像，可以得到蛋白质的三维结构。
电子显微镜在解析大分子复合物和蛋白质超分子结构方面具有独特的优势。
四、质谱法质谱法是一种通过测量蛋白质的质量和电荷来解析其结构的方法。
质谱法可以分析蛋白质的分子量、氨基酸序列、修饰和折叠状态等信息。
常见的质谱法包括质谱仪、飞行时间质谱和串联质谱等。
质谱法可以快速、高效地分析蛋白质样品，特别适用于高通量蛋白质组学研究。
五、计算方法除了实验方法外，计算方法也在蛋白质结构解析中发挥着重要作用。
通过计算方法，可以预测蛋白质的二级结构、三级结构和折叠动力学等信息。
常用的计算方法包括分子力学模拟、蒙特卡洛模拟和分子动力学模拟等。
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构X射线晶体衍射是一种常用的方法，用于研究蛋白质的三维结构。
它提供了高分辨率的信息，可以确定蛋白质的原子坐标和结构细节。
本文将介绍X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构的过程和应用，并讨论一些相关的技术和方法。
首先，为了进行X射线晶体衍射，研究者需要获得蛋白质的高质量晶体。
蛋白质晶体的制备是一个关键步骤，它要求蛋白质具有高纯度和稳定的结构。
通常，蛋白质晶体的制备是一个经验性的过程，需要优化各种条件，如蛋白质浓度、缓冲液pH值、添加剂和结晶温度等。
一旦获得了合适的晶体，就可以进行下一步的X射线衍射实验。
在X射线晶体衍射实验中，晶体被放置在X射线束中，并旋转以产生衍射图样。
这些衍射图样可以通过衍射仪器进行收集和记录。
X射线束的穿过晶体会与晶体中的原子相互作用，并被散射。
通过测量衍射方向和散射强度，可以推断出晶体中原子的空间分布。
衍射图样经过处理、解析和模型建立，可以得到蛋白质的三维结构。
X射线晶体衍射是一种非常强大和广泛应用的技术。
它可以用于解析各种蛋白质的结构，包括酶、抗体和膜蛋白等。
通过比较不同蛋白质的结构，研究者可以揭示蛋白质功能和机制。
另外，X射线晶体衍射还可以用于蛋白质药物设计和优化。
通过了解蛋白质与小分子结合的方式和结构细节，可以指导药物开发和设计更有效的药物。
尽管X射线晶体衍射是一种强大的技术，但它也存在一些限制。
首先，制备高质量晶体是一个挑战，有些蛋白质很难获得足够的高质量晶体。
其次，X射线晶体衍射测定的过程是非常耗时的，通常需要几个月甚至几年的时间来完成。
最后，一些结构细节可能无法通过X射线晶体衍射来解析，因为这种技术只能提供静态结构的信息，而无法直接观察蛋白质的动态过程。
为了克服这些限制，科学家们一直在不断改进和发展X射线晶体衍射技术。
例如，他们引入了新的结晶方法和结晶辅助技术，以提高晶体质量和产量。
此外，还开发了一些高通量的实验和自动化的方法，以加快实验过程和数据处理。
X射线测定蛋白质结构的技术进展与研究现状
X射线测定蛋白质结构的技术进展与研究现状熊强;丁立新;姜晓燕;丁库克【摘要】X射线晶体衍射技术是一种非常重要的测定蛋白质晶体结构的方法.近几十年,虽然各种新的实验方法和通过计算机预测蛋白质结构域的方法层出不穷,但是测定蛋白质结构主要还是通过X射线晶体衍射技术.随着同步辐射装置和X射线自由电子激光的发展,X射线在测定蛋白质结构中的作用越来越重要.本文就X射线测定蛋白质晶体空间结构的技术进展进行综述,介绍了其原理和发展,简述了同步辐射和X射线自由电子激光的研究现状,为理解用X射线测定蛋白质结构的机制,从原子水平上了解生命物质奠定基础,并提出今后X射线光源的发展趋势.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2019(031)001【总页数】4页(P82-85)【关键词】蛋白质晶体结构;X射线晶体衍射技术;同步辐射;X射线自由电子激光【作者】熊强;丁立新;姜晓燕;丁库克【作者单位】中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学中心放射生态研究室,北京100088;中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学中心放射生态研究室,北京100088;中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学中心放射生态研究室,北京100088;中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学中心放射生态研究室,北京100088【正文语种】中文【中图分类】O743+.52蛋白质是生命活动的主要执行者之一，正确且完整的结构是保证其正常功能发挥的前提，因此蛋白质结构的研究是目前最热门的研究领域之一。
对蛋白质三维结构的研究，一方面对于深入了解生物体内的生命过程有重要意义，另一方面对于重大疾病的预防和治疗、新型高效药物和疫苗的研发等有重要的作用。
目前测定蛋白质三维结构的实验方法主要有X射线晶体衍射技术（X-ray crystalline diffraction）、多维核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和低温冷冻电镜等[1]（表 1）。
分子生物学研究中的蛋白质结晶与X射线衍射技术应用
分子生物学研究中的蛋白质结晶与X射线衍射技术应用蛋白质是分子生物学中的重要组成部分，它们是细胞中的基本单位，参与了各种生物过程。
研究蛋白质结构对深入了解其功能和生物活动机理非常重要。
然而，蛋白质的结晶过程是一个复杂而艰难的过程。
X射线衍射技术是目前蛋白质结晶研究中最常用的方法之一，其应用越来越广泛。
一、蛋白质结晶的重要性蛋白质结晶是蛋白质研究中至关重要的一个步骤。
只有将蛋白质结晶为固定的晶体形态，才能进行后续的结构研究。
通过X射线衍射技术，我们可以得到蛋白质的高分辨率结构信息，揭示其功能和作用机理。
二、蛋白质结晶的挑战然而，蛋白质结晶是一个困难而复杂的过程。
蛋白质结晶的成功取决于复杂的因素，如蛋白质本身的性质，结晶试剂的pH值、浓度、温度、离子强度等等。
对于大多数蛋白质而言，结晶的成功率非常低，常常需要尝试数百次，甚至上千次才能获得结晶。
三、蛋白质结晶的解决方法解决这一问题的方法是使用各种结晶试剂和结晶策略，以增加结晶的成功率。
其中最常用的结晶试剂包括PEG、NaCl、MES、Tris等，而结晶策略则包括温度梯度法、蒸发法、振荡法、比重悬液法等。
在蛋白质结晶过程中，其他因素也会对结晶产生影响。
例如，蛋白质的来源、表达方式、纯度和稳定性都会影响结晶的成功率。
因此，在进行蛋白质结晶前，我们需要对蛋白质进行表达、纯化和鉴定等前期工作。
四、X射线衍射技术的优势X射线衍射技术是目前蛋白质结晶研究中的重要手段之一。
该技术通过探测晶体中分子所散射的X射线，推断出蛋白质的三维结构。
由于X射线波长非常短，因此能够对物质的微观结构进行高分辨率的描述。
X射线衍射技术的优点在于其高效、快速、非破坏性、可重复性强。
同时，X射线衍射技术在能够揭示分子的原子水平结构信息。
五、X射线衍射技术的缺陷然而，X射线衍射技术也有一定的局限性。
例如，它不能够确定分子的动态过程和和重要功能区域的构造。
另外，X射线衍射技术通常需要大量的蛋白质晶体。
蛋白质二级结构的检测手段
蛋白质二级结构的检测手段蛋白质的二级结构指的是蛋白质中肽链的局部空间排列方式，包括α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构。
了解蛋白质的二级结构对于理解其功能和特性具有重要意义。
为了检测蛋白质的二级结构，科学家们开发了多种方法和技术。
本文将介绍一些常用的蛋白质二级结构检测手段。
1.X射线晶体学：这是最常见也是最有效的蛋白质二级结构分析方法之一、这种方法需要通过蛋白质晶体的形成来得到高质量的X射线衍射数据，然后利用这些数据进行结构解析。
通过分析X射线衍射图样中的强度与角度关系，可以得到蛋白质的空间结构信息。
这种方法可以确定蛋白质中α-螺旋和β-折叠的位置和长度等二级结构信息。
2.核磁共振（NMR）：NMR是一种基于蛋白质分子中核自旋的物理性质的技术。
通过蛋白质溶液中核自旋发生的共振现象，可以获得蛋白质的二级结构信息。
NMR可以提供关于蛋白质的动态和局部结构的详细信息，并且对于无规卷曲结构的检测也非常有效。
3.傅里叶变换红外光谱（FTIR）：这种方法可以通过测量蛋白质在特定波长范围内吸收红外光的情况来确定其二级结构。
蛋白质的不同二级结构在红外光谱中呈现出不同的吸收峰和吸收强度，通过分析这些特征可以得到蛋白质的二级结构信息。
4.圆二色谱（CD）：圆二色谱是一种通过测量蛋白质对圆偏振光的旋光性质来确定其二级结构的方法。
蛋白质的不同二级结构对圆偏振光产生不同程度和方向的旋光效应，通过测量旋光谱可以得到蛋白质的二级结构信息。
5.传感器技术：近年来，一些新兴的蛋白质二级结构检测技术基于传感器原理的研究也在迅速发展。
例如，基于表面等离子体共振（SPR）和电阻性微流控芯片等技术，可以实时、高灵敏地检测蛋白质表面的结构变化。
综上所述，蛋白质二级结构的检测手段多种多样，包括X射线晶体学、核磁共振、傅里叶变换红外光谱、圆二色谱和传感器技术等。
这些方法可以通过测量蛋白质的物理性质、光学性质和化学性质等，获得蛋白质二级结构的信息。
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构
• 晶胞(Unit cell)
✓ 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。
✓ 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 • 选择平行六面体的原则：
• ①所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 • ② 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 • ③ 所选平行六面体之体积应最小。 • ④ 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距
• 为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器 。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像 重建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也就是已被广泛应用的CT。
X射线与诺贝尔奖—物理学奖
• 伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 • 1903 年诺贝尔物理学奖。 • 1906 年的诺贝尔物理学奖。 • 劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。 • 英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。 • 英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。 • 瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。 • 美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。 • 前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖; • 美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖; • 瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。
rometry, DXMS • 生物玻璃bioglass
边界 硬度 脱水 溶解性 偏光性 染色性 漂浮性
（4）晶体的初步鉴定
小分子晶体
蛋白质晶体
完整，漂亮
常不完整，易出现多晶
偏硬，易碎成2瓣或几瓣 偏软，易碎成粉
不变化
因脱水而变坏
慢
快
强
X射线晶体衍射技术应用于蛋白质晶体结构检测ppt课件
经过滤波器〔如镍片等〕得到一定波 长的单色X-射线； • 单色X-射线经过晶体，产生衍射线， 用照相机记录下来，得到衍射图； • 然后，经过对衍射斑点的位置与强度 的测定与计算，并参照化学分析的结 果，就可确定晶体构造。
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根本原理
• 根据晶体中原子反复出现的周期性构造。当X-射线穿过晶体的原 子平面层时，只需原子层的间隔d与入射角的X-射线波长λ、入射 角θ之间的关系能满足布拉格(Bragg)方程式：
• 2d sinθ=nλ( n =±1,±2,±3,…) • 那么反射波可以相互叠加而产生衍射，构成复杂的衍射图谱。
不同物质的晶体构成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下来的 衍射图谱，经过复杂的数学处置，可推知晶体中原子的分布和分 子的空间构造。
• X-射线衍射法是测定蛋白质晶体构造的极其重要方法。
• 经过X-射线衍射法〔X-ray diffraction method〕可间接 地研讨蛋白质晶体的空间构造。对晶体构造的研讨将协 助人们从原子的程度上了解物质。
• 虽然，生物大分子X射线晶体学是提示分子构造与功能 的科学。但目前还没有一种工具可以用它直接察看到蛋 白质内部的原子和基团的陈列。
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测定步骤
1. 培育大的、质量好的晶体 2. 进展初步的x射线衍射分析； 3. 重原子衍生物的制备； 4. 衍射数据的丈量和处置； 5. 相位的计算； 6. 电子密度图的计算和解释； 7. 分子模型的修正。
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获得好的晶体是 构造分析中最关键的一步
• 欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性(如， 手性的一致性等)是能否获得完好结晶的关键 之一。
蛋白质三维结构解析方法
蛋白质三维结构解析方法蛋白质是生物体中最为广泛存在的一种生物大分子，它不仅构成了细胞的主要结构组分，还参与了细胞生物学和生物化学中的许多重要生命过程。
蛋白质的功能和性能与其三维结构密切相关，因此蛋白质的三维结构解析方法对于揭示其功能和设计新的药物分子具有重要意义。
本文将介绍一些常用的蛋白质三维结构解析方法。
1. X射线晶体衍射方法X射线晶体衍射方法是解析蛋白质三维结构最常用的方法之一。
该方法利用X射线与蛋白质晶体相互作用的原理，通过测量和分析X射线在晶体中的衍射图样，推导出晶体的三维结构。
这种方法具有高分辨率、高精度和高可靠性的优点，可以解析蛋白质的原子级结构。
2.核磁共振方法核磁共振是一种基于核磁共振现象的物理方法，可以用来解析蛋白质的三维结构。
核磁共振方法通过测量蛋白质中核自旋的共振信号，获取蛋白质的二维或三维核磁共振谱图，从而得到其结构信息。
这种方法可以直接在溶液中测量蛋白质的结构，对于大分子和多肽的结构解析具有优势。
3.电子显微镜方法电子显微镜是一种高分辨率成像技术，可以观察到原子级别的细小结构。
电子显微镜方法可以应用于蛋白质的分子结构解析。
通过将蛋白质样品制备成薄层，并利用电子束对其进行成像，然后通过图像处理和模型重建等方法，得到蛋白质的三维结构。
近年来，随着电子显微镜的技术进步，已经取得了许多重要的蛋白质解析结果。
4.聚合物折叠模型方法聚合物折叠模型方法是一种在计算机上模拟和预测蛋白质三维结构的方法。
这种方法基于物理学原理和化学原理，通过计算和模拟蛋白质分子的能量最小化或模拟折叠过程，从而得到蛋白质的结构模型。
聚合物折叠模型方法可以快速预测蛋白质的结构，对于大规模的结构预测和构建蛋白质库非常有用。
5.光学光谱方法光学光谱方法利用光的吸收、散射、发射等性质，来研究蛋白质的结构和性质。
常用的光学光谱方法包括紫外-可见光吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。
这些方法可以通过测量蛋白质在不同波长、不同环境下的光学性质，来推测其分子结构和构象变化。
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蛋白质晶体培养一般规律
• 蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个
有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成 有规则排列状态的固体。
•
通常认为形成晶体的过程需要：
① 一定大小的晶核 过饱和溶液 ② 溶液达到过饱和 ③ 并保持一定的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量 (平移、旋转等)而结合到晶核上
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X-射线结构分析法（X-光衍射法）
• 工作原理：
• 由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过滤波器 （如镍片等）得到一定波长的单色X-射线； • 单色X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下 来，得到衍射图； • 然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定与计算， 并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。
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NaCl 晶体 结构
X-ray发展历史
• 1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; • 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了 测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的 距离和排列。因此获诺贝尔奖。 • 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽 链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 • 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三 维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 • 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解 决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用
衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。
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测定步骤
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 培养大的、质量好的晶体 进行初步的x射线衍射分析； 重原子衍生物的制备； 衍射数据的测量和处理； 相位的计算； 电子密度图的计算和解释； 分子模型的修正。
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晶体结构的基本知识
1.
Байду номын сангаас
2. 3. 4.
日常所见的许多晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原 子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组 成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组相互平行的、情况相同的平面点阵所 组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图 上斑点的位置与黑度。
θ
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晶体的衍射
• X射线晶体结构分析是利用晶体的X射线衍射现象来 测定晶体及分子的结构。 • 通常X射线衍射可简单理解为当一束平行的X射线投 射到晶体上时，大部分入射线穿过晶体沿原方向前进， 而部分射线却偏离了入射方向。
衍射线
X射线源
入射线
晶体
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Protein Structure By X-RayCrystallography
Obtain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z) ;Place poly-peptide chain into electron density.
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获得好的晶体是 结构分析中最关键的一步
• 欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性(如， 手性的一致性等)是能否获得完好结晶的关键 之一。 • 重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。 由高效表达克隆基因获得的蛋白质能够快速获 得纯化，并且只需很少的纯化步骤就能得到均 一的样品。 • 一般来说，一个蛋白质样品要想使其能结晶， 至少需要97%的均一性。
X射线晶体衍射技术
在蛋白质晶体结构测定中的应用
2014-4-24
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Definition of X-ray Diffraction
• X射线晶体结构分析是使用X射线作为物理 工具，以晶体作为研究对象，晶体结构作 为研究结果的一种方法。
• 包含两个方面的内容：X射线和晶体。
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Introduction of X-ray Diffraction
2014-4-24
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基本原理
• 根据晶体中原子重复出现的周期性结构。当X-射线穿过晶体的原 子平面层时，只要原子层的距离d与入射角的X-射线波长λ、入射 角θ之间的关系能满足布拉格(Bragg)方程式：
2d sinθ=nλ( n =±1,±2,±3,…)
则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射图谱。不同 物质的晶体形成各自独特的 X- 射线衍射图。根据记录下来的衍射 图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分布和分子的 空间结构。 平行光束 原子层 d d
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X射线晶体结构测定原理
• 晶体的衍射花样与晶体内部的结构有一定的关系， 即衍射花样内衍射点的排列方式、点间距离的大小 与晶体内生物大分子的排列方式和重复周期大小有 关，而衍射点的强度分布与生物大分子结构本身的 特点有关。 因此
① 通过分析衍射点的排列方式和测量点间距离的大小来推算分子 在晶体结构中的排列方式和重复周期的大小 ② 通过测量衍射点的强度，应用一系列数学方法，借助电子计算 机可测定分子内每个原子在空间的坐标，从而测定整个分子的 结构和晶体结构。
• X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。 • 通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接 地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮 助人们从原子的水平上了解物质。 • 虽然，生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能 的科学。但目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋 白质内部的原子和基团的排列。
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PROTEUM系统适用于生物大分子结构测定
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