pcr说明及注意事项
pcr的使用方法及注意事项
pcr的使用方法及注意事项嘿，咱今儿就来聊聊 PCR 这玩意儿的使用方法和那些得注意的事儿。
PCR 啊，就像是一个神奇的魔法盒子，能让咱把特定的基因片段给变出来。
那怎么用它呢？首先，得准备好各种材料，就像厨师要准备食材一样。
咱得有模板 DNA，这可是关键的原料哦，就好比做菜得有主要食材。
然后呢，还得有引物，这就像是给魔法盒子设定的咒语，得准确无误才行。
接着，把这些东西都放到反应体系里，就像把食材都放进锅里一样。
然后设置好温度和时间等条件，这就像是掌握好火候。
温度一会儿高一会儿低，就跟炒菜时大火小火来回换似的。
在这个过程中，可得注意好多事儿呢。
比如说，实验环境得干净整洁，不能有其他乱七八糟的东西干扰，不然就像做菜时掉进了脏东西，那可不行。
再比如，操作得仔细认真，不能马虎大意，就跟切菜不能切到手一样。
还有啊，那些试剂可都金贵着呢，不能随便浪费。
就像你好不容易买了好食材，不得好好珍惜着用呀。
而且，每次加试剂都得准确量取，多了少了都可能出问题，这可不像做菜时盐多放一点少放一点那么简单。
另外，仪器设备也得维护好，就像你得爱护你的宝贝厨具一样。
要是仪器出了毛病，那实验可就没法好好进行啦。
PCR 这个魔法盒子，能让我们在微观世界里大显身手。
但咱得用对方法，注意好细节，才能让它发挥出最大的作用。
要是不小心弄错了，那可就前功尽弃啦，就像做了一桌子菜结果都不好吃一样，多让人郁闷呀。
所以啊，大家在使用 PCR 的时候，一定要小心翼翼，把每个环节都做好。
这可关系到我们的实验结果呢，可不能马虎。
记住这些要点，让我们一起在 PCR 的世界里畅游，探索那些神奇的基因秘密吧！怎么样，是不是觉得挺有意思的呀？反正我是这么觉得，PCR 真的很神奇，很有趣呢！。
PCR仪器的使用及注意事项
PCR仪器的使用及注意事项PCR仪器（聚合酶链式反应仪）是用于在体外合成DNA的关键仪器，其具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点。
在科研领域，PCR仪器被广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变分析等实验中。
本文将介绍PCR仪器的使用方法及注意事项。
1.使用方法（1）准备样品：将需要进行PCR的DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶按照配比加入PCR反应管中，并确保样品完全溶解。
（2）设置PCR程序：根据实验需要设置PCR程序，包括温度梯度、循环次数等参数。
（3）装载PCR反应管：将混合好的PCR反应管放入PCR仪器的样品槽中，注意不要产生气泡。
（4）运行PCR程序：启动PCR程序，跟踪反应过程中的温度变化，确保程序正常运行。
（5）分析PCR产物：将PCR产物进行电泳分析或其他实验操作，检查PCR反应的效果。
2.注意事项（1）严格遵守无菌操作规范：在进行PCR实验前，必须保证实验操作环境和操作工具的无菌干净，以防止外源DNA的污染影响PCR反应结果。
（2）避免反应管交叉污染：在操作PCR反应管时，要避免反应液的溅出和反应管之间的交叉接触，保持每个反应管的PCR反应独立进行。
（3）严格控制温度：PCR反应的温度是影响反应结果的重要因素，必须严格控制PCR仪器的温度梯度和循环次数，避免因温度波动导致PCR 反应不稳定。
（4）避免电泳误判：在对PCR产物进行电泳分析时，要注意区分PCR产物和非特异产物，避免因PCR产物的数量或大小而误判实验结果。
（5）及时清理PCR仪器：使用完PCR仪器后，要及时清理反应槽和反应管槽，避免因污染影响下次实验的结果。
总之，PCR仪器的正确使用方法和注意事项对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
科研人员在使用PCR仪器时，务必严格遵守操作规范，保证实验操作的准确性和可重复性，从而获得稳定可靠的实验数据。
PCR技术的应用将为生物学、医学和其他领域的研究提供重要支持和帮助。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
pcr 操作中最应该注意的事项
pcr 操作中最应该注意的事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
在进行PCR操作时，有一些非常重要的事项需要特别注意，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是在PCR操作中最应该注意的事项：1. 实验室操作规范：在进行PCR操作之前，需要做好实验室操作规范的准备工作，包括戴好实验手套、穿好实验服、清洁操作台面等。
避免在实验室中进食、饮水或使用手机等。
2. 检查实验仪器和试剂：在开始PCR实验之前，需要确保PCR仪器的正常运转和试剂的完整性。
检查PCR仪器的温控系统、离心机的转速、试剂的保质期等，确保实验条件的准确性。
3. 建立阳性和阴性对照：在每次PCR实验中，都要包括阳性对照和阴性对照，以验证实验的准确性。
阳性对照应包括已知的阳性样品，而阴性对照则应该是未添加DNA模板的反应混合物。
4. 采用单独的PCR实验室：为了避免PCR实验中的污染，最好在专门的PCR实验室中进行实验，避免与其他实验室中的DNA样品混合。
5. 严格控制实验条件：在PCR实验中，需要严格控制实验条件，包括温度、时间、试剂比例等。
确保PCR反应体系的均匀混合、温度梯度的准确性和反应时间的精确控制。
6. 避免污染：PCR实验非常容易受到外源DNA的污染，因此需要避免在实验室中的DNA样品和PCR产物的交叉污染。
实验中应该使用滤器枪头、一次性试剂盒等措施，避免污染的发生。
7. 定期维护PCR仪器：PCR仪器的维护对实验的准确性非常重要。
定期清洁PCR仪器的加热盖、检查温度控制系统的准确性、更换磁力搅拌器的磁子等，确保PCR仪器的正常运转。
8. 标记实验样品：在进行PCR实验时，需要对实验样品进行正确的标记，包括样品的编号、实验日期、PCR程序名称等。
避免实验样品的混淆和实验结果的不准确。
9. 注意PCR产物的保存和处理：PCR产物的保存和处理对实验结果的可靠性有着重要的影响。
pcr的操作及注意事项
PCR的操作及注意事项一、PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR技术的广泛应用，使得其操作和注意事项变得尤为重要。
本文将介绍PCR的操作步骤以及需要注意的事项。
二、PCR的操作步骤1. DNA提取首先，需要从样本中提取目标DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿法、热碱法和商业DNA提取试剂盒。
在提取DNA的过程中，应注意减少污染，保持工作区域清洁。
2. PCR反应液的配制将PCR反应液的各种试剂按照实验方案的要求配制好，主要包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶。
保持试剂的新鲜和纯净，避免重复冻融。
3. PCR反应的设置将PCR反应液分装到反应管中，可根据需要设置多个反应管。
注意反应管的密封性，避免样品蒸发和污染。
同时，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸的温度和时间。
4. PCR反应的程序将反应管放入PCR仪中，启动PCR程序。
确保PCR仪的温度控制准确可靠，保持反应过程的稳定性。
根据目标DNA片段的大小，调整PCR的循环次数，一般为25-35个循环。
5. PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过各种方法对PCR产物进行分析，常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
分析结果能够验证PCR扩增的特异性和产物的纯度。
三、PCR操作的注意事项1. 高品质的DNA模板PCR反应的成功与否与DNA模板的质量有很大关系。
因此，在进行PCR实验前，应确保使用高质量的DNA模板，如通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2. 引物的设计和质量PCR反应中使用的引物应具有较高的特异性和准确性。
在设计引物时，应避免引物间的互补性，以免出现非特异扩增。
同时，引物的质量也很重要，选择高纯度的引物可以提高PCR反应的成功率。
3. 操作区域的消毒与隔离为了避免PCR反应过程中的污染，应定期对实验区域进行消毒，如操作台面、工作台和仪器表面。
检验科pcr技术流程及注意事项
检验科pcr技术流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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PCR的基本步骤及注意
PCR的基本步骤及注意聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的技术，可以在短时间内生成大量目标DNA分子。
这项技术有助于分子生物学、基因工程、医学诊断和法医学等领域的研究。
1.临床分配试剂和试管：将PCR反应所需的试剂和试管按需求分配到不同的试管中。
要确保试剂处于适当的温度，避免暴露于高温和冷藏温度。
2.准备DNA样本：从所需样本中提取目标DNA序列。
此步骤可能需要使用DNA提取试剂和特定的样本处理方法。
3.DNA扩增：在PCR试管中，添加目标DNA序列的模板，然后加入DNA聚合酶、引物（前向和反向引物）和缓冲液。
将试管放入PCR热循环仪。
4.PCR循环条件：PCR循环通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤将模板DNA变性为两条单链DNA；退火步骤允许引物与目标序列配对；延伸步骤将DNA聚合酶沿引物向目标DNA序列延伸，并在每个PCR循环中产生新的DNA分子。
5.PCR循环次数：PCR反应包含多个PCR循环，每个循环都由变性、退火和延伸步骤组成。
PCR循环次数的选择取决于所需扩增的目标DNA的数量。
6.凝胶电泳：将PCR反应产物进行凝胶电泳检测。
通过电泳可以将PCR产物分离出来，并根据其大小进行检测和分析。
PCR注意事项如下：1.PCR试剂的储存和使用：所有PCR试剂都应存储在适当的温度下，并且在使用之前应检查其有效期。
如果试剂过期，可能会对PCR反应产生不可预测的结果。
2.样本处理和DNA提取：样本处理和DNA提取步骤的准确性对PCR结果的可靠性至关重要。
应遵循标准样本处理和DNA提取的步骤，并确保使用无污染的试剂和材料。
3.引物的设计：引物是PCR反应中的重要组成部分，其设计应遵循一定的原则。
引物应具有与目标DNA序列特异性互补的序列，并且长度应适当，通常在20-30个碱基对之间。
4.反应混合物的准备：在混合PCR反应的试管中，应遵循正确的操作步骤，确保所有试剂都得到正确添加，并完成适当的混合。
pcr实验中的注意事项
pcr实验中的注意事项PCR 实验中的注意事项PCR（聚合酶链式反应）实验是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于扩增特定的 DNA 片段。
在进行 PCR 实验时，有许多注意事项需要牢记，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前的准备1、设计合适的引物引物的设计是 PCR 实验成功的关键之一。
引物的长度一般在 18 25 个碱基之间，GC 含量应在 40% 60%之间，并且要避免引物自身形成二级结构和引物之间的互补。
可以使用在线引物设计软件来辅助设计，但设计完成后需要进行仔细的评估和验证。
2、准备高质量的模板 DNA模板 DNA 的质量和纯度对 PCR 结果有很大影响。
DNA 应尽量纯净，避免蛋白质、RNA 等杂质的污染。
可以使用 DNA 提取试剂盒来提取 DNA，并通过分光光度计测量其浓度和纯度。
3、选择合适的 PCR 试剂包括 DNA 聚合酶、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）、缓冲液等。
不同的 DNA 聚合酶具有不同的特性，如保真度、延伸速度等，应根据实验需求进行选择。
dNTPs 的浓度要合适，过高或过低都会影响 PCR 反应。
缓冲液的成分和 pH 值也会影响反应的效率。
4、准备干净的实验器具PCR 实验对污染非常敏感，因此使用的移液器、离心管、PCR 管等器具都要经过严格的清洗和灭菌处理，以避免外源 DNA 的污染。
二、实验中的操作1、严格控制反应体系的配制按照实验方案准确地加入各种试剂和模板 DNA，注意移液器的使用规范，确保加样的准确性和一致性。
在加样过程中，要避免试剂和模板的交叉污染。
2、设置对照实验对照实验对于判断 PCR 结果的可靠性非常重要。
常见的对照包括阳性对照（含有已知目标 DNA 片段的样品）、阴性对照（不含目标DNA 片段的样品）和无模板对照（只含反应试剂而不含模板 DNA 的样品）。
通过对照实验，可以检测试剂是否污染、反应体系是否正常以及是否存在非特异性扩增等问题。
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然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用 一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以第一链cDNA为 模板，进行PCR循环，
3‘Race
1，(dt)17接头引物引导cDNA第一链 合成 2，特异性引物引导合成cDNA第二链 3，特异性引物和与接头引物互补的 引物做PCR 4，克隆至质粒载体做序列分析
要将两段100多个碱基的片段连起来 用PCR可以吗？？没有酶切位点！各位 高手可否介绍一下经验？？连接PCR要 注意些什么？？多谢！！！ (丁香园某求助帖）
可以。我就这样做过。 1. 针对这两个片段设计两对引物。第一对引 物的下游引物和第二对引物的上游引物各长 40bp左右，并有20bp左右的同源性配对序 列（象骨折打的石板）。 2. 分别PCR这两段序列，并分别回收纯化这 两个PCR片段。 3. 将上述两个PCR片段加入一PCR体系中， 只不加引物，其他同普通的PCR，做PCR。 4. 回收200多bp的PCR目的片段。放入测序 载体，测序证实。 (丁香园某回答贴）
DNA聚合酶的选择
本实验室经常使用宝生物的Taq酶
rTaq： 普通Taq酶，1kb以下片断使用比较 合适
EX－Taq 具有一定的保真性，2kb以下片断使 用比较合适 LA－Taq 保真性比EX－Taq要好，适用于2kb 以上的片断
关于高保真DNA聚合酶（pfu）
1，具有3‘－5’核酸外切酶活性，所以具 有保真性 2，PCR产物末端没有T 3, 扩增效率往往不如普通Taq酶，可以 用普通Taq酶和pfu按20：1混合使用
(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探 针(4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析；
我们可以利用PCR做些什么工作 克隆基因，构建质粒 扩增核酸，用于检验 质粒点突变 连接(overlap PCR)
不出现扩增条带
不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量， ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析 研究。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非 特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全 互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的 质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来 源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩 增。
模板： ①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有Taq酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组 蛋白， ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出 现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提 取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理 液，其程序亦应固定不宜随意更改。
PCR技术的基本原理
1, 变性：一般93～95度
pcr.swf.swf
2, 退火：一般55度左右，根据具体 的情况决定
3，延伸：一般72度,PCR产物每kb一 分钟
常用的PCR技术
普通PCR RT-PCR Race PCR 巢式PCR Real-time PCR
通常，PCR在分子克隆和DNA分析 中有着以下多种用途：
PCR技术浅淡
微生物教研室：曹康
PCR技术产生的背景：
DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细 胞里携带遗传信息的分子。 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶polymerase， 即PCR之P），也早在1956年分离成功。 几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行 工作。
PCR的发明人，一 般公认是穆里斯（K. Mullis），他于1983 年发明了PCR技术， 这是分子生物学上 的一次革命，他也 因此获得了1993年 的诺贝尔化学奖。
5. 尽量避免引物二聚体特别是3‘端引物二聚 体
6，尽量避免错配，特别是3‘端错配
7，尽量避免3‘端最后一个碱基是A。 8，上下游Tm值相差最好不要超过5°C
9， Tm值的计算： Tm＝4×（G＋C） ＋2×（A＋T）(本公式适用于20个碱 基以下，20个碱基以上推荐使用软件计 算） 10,根据需要可在引物5‘端加入酶切位 点和保护碱基
关于PCR引物设计的思考 1，任何引物设计软件都不能代替人性
化的思考。2,核酸结构是三维的，而一般的 引物设计软件很难考虑到核酸的三维结构。 3，理论与实践并不一定完全一致
关于PCR试验结果的思考
影响PCR的主要因素
怎样理解 PCR技术？ 1，模板 模板在PCR反应中起至关重要的作用， 常见的模板性质： A 质粒DNA B 基因组DNA C RNA(RT-PCR)
hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合 酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然 有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中， 以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度 时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物 一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计 的位点因为遗传元件的定位而受限时，热启动 PCR尤为有效。
overlap PC物之前应当明确PCR试验的目 的以及各种资料和信息 1. 引物长度一般为18-35bp,以保证特异性.当 然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特 异性
2，上下游引物长度相差一般不超过3个碱基
3. 引物GC含量尽量是40％－60％
4. 尽量避免发卡结构，特别是3‘端发卡结构
2，引物 引物的特异性很重要 3，引物浓度 0.1~1pmol/ul 引物浓度太低PCR产量低， 引物浓度太高容易引发非特异性扩增。
Mg离子浓度
Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸 骨架相互作用 并能影响Polymerase的活 性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM 之间调整，同样要记住的是在调整了 dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的 浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓 度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～ 2.0mmol/L为宜
11,引物设计的最后一项：Genebank网 比对/Blast
使用软件帮助设计引物
目前常用的引物设计软件有Primer Primier 5.0和Oligo以及其他各种软件和一些 网上在线设计，其中以Primer Primer 5.0功 能最全最为常用。 Primer Primer 5.0的主要功能有：分析 限制性内切酶位点，自动搜索，手动设计 等功能。
Real-time PCR
real-time PCR flash.swf
PCR究竟能扩多长的片段？
RNA模板： 使用一般的试剂，RT-PCR一般只 能扩到2kb左右 质粒模板：5kb一般不成问题 基因组DNA模板：使用特殊的酶和缓冲液原理 上讲可以扩出10～25kb (长距离PCR）
RT-PCR
一步法和二步法
各有优缺点。比较如下： 二步法: 可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异 性引物进行第一链合成。高灵活性：可选用不 同的酶系统。可优化困难的RT-PCR反应。可实 现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。 最适用于克隆产物(使用高确限 度酶或混合酶) 。
一步法: 第一链合成时只能使用基因特异性引物。 高 灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和 Taq聚合酶，可检测到低至0．1pg的mRNA。 高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步 骤少，减少污染机会。最适于大量样品的分 析。
PCR反应条件的摸索
总的原则：
1，做任何实验要有对照 2，做任何实验要变通，走多条路，不要 在一棵树上吊死。
5‘ Race技术
利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反 转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性， 在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上 3一5个(dC)残基
含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头 引物与cDNA第一链配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。
对策有： ①必要时，重新设计引物。 ②减低酶的量或调换另一来源的酶。 ③降低引物量，适当增加模板量，减少循 环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法 (93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步 法)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原 因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有： ①减少酶的量，或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓 度。 ④增加模板量，减少循环次数。
Mg离子浓度升高则PCR特异性增加， Mg 离子降低则有可能出现非特异性扩增
退火温度
升高退火温度PCR产量低，降低退火温度 则有可能出现非特异性扩增
关于酶切位点与保护碱基
保护碱基的个数：(NEB) BamHⅠ 1 EcoR Ⅰ 1 Hind Ⅲ 2 Xho Ⅰ 1 PstⅠ 3 Xba Ⅰ 1 保护碱基的性质：灵活处理