PCR注意事项总结
PCR使用注意事项有哪些
PCR使用注意事项有哪些PCR（聚合酶链式反应）在分子生物学研究中扮演着重要的角色。
它是一种高度敏感、高度特异的技术，用于扩增特定的DNA序列。
虽然PCR技术相对简单，但在使用时仍需注意以下事项才能确保结果准确可靠。
1. 实验室准备a. 工作台和仪器确保实验室工作台、仪器以及所有用具都处于洁净状态，并进行彻底清洁和消毒，以避免污染样品。
b. 基因室PCR实验通常在基因室进行，以尽量减少外部DNA的干扰。
基因室应遵循严格的无菌操作和试验装备清洁标准。
c. 防止污染实验操作：避免接触外部DNA源，如手指、衣物等。
戴手套，使用洁净的微量移液器，并保持小心操作。
试剂和试验装备：选择高质量的试剂，并避免接触可能被污染的物品。
每个试剂都应有专用的洁净工具，避免交叉污染。
2. 样本处理a. 样本采集样本采集时应采取适当的操作方法，并严格遵循相关伦理规定。
确保样本收集后尽快进行处理。
b. DNA提取DNA提取过程要注意有效去除可能影响PCR的抑制物质（如血液中的血红素）。
遵循适当的提取方法和相关操作规程。
c. 样品储存如果无法立即处理样品，应储存于低温下以防止DNA降解。
遵循适当的样品储存条件和时段。
3. 试剂与引物a. 试剂质量选择高质量的试剂，特别是聚合酶和缓冲液等关键试剂。
定期检查试剂的有效期限。
b. 引物设计引物设计的合理性对PCR结果至关重要。
确保引物序列与目标DNA序列完全匹配，并考虑二聚体和其他非特异性连接的可能性。
4. PCR反应a. 反应体系反应液配制：精确称量和混合所有试剂，并使用无菌过滤器过滤以避免污染。
遵循特定的反应体系和配方。
反应管选择：使用透明、无RNase/DNase的PCR管，以充分观察反应过程和减少污染风险。
b. 循环条件PCR循环条件（如温度和时间）应根据模板DNA和引物的特性进行优化。
适当的循环条件可以提高PCR的特异性和准确性。
c. 阶段控制控制PCR反应的每个阶段的时间和温度，以确保充分扩增目标序列，并避免异源DNA污染。
pcr扩增实验注意事项
pcr扩增实验注意事项PCR扩增实验注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，可在短时间内迅速扩增DNA片段。
PCR实验的成功与否直接影响实验结果的准确性和可靠性。
为了确保PCR实验的顺利进行，以下是一些值得注意的事项。
实验前的准备工作在进行PCR实验之前，必须进行充分的准备工作。
这包括准备PCR试剂，如引物、模板DNA和聚合酶等，以及实验器材的消毒。
1.引物的设计与选择PCR扩增所需的引物应具有良好的特异性，能够与待扩增的目标DNA序列完全互补。
引物的设计可以借助于计算机软件进行，以确保引物的特异性和扩增效率。
此外，引物的长度应适中，通常选择15-30个核苷酸的长度。
2.模板DNA的准备与稀释模板DNA是PCR扩增的起点，它必须具有足够的纯度和浓度。
在准备模板DNA时，应注意避免DNA的降解和污染。
同时，还需要将模板DNA 稀释到适当的浓度，以确保PCR反应的最佳效果。
3.实验器材的消毒PCR实验需要在无菌条件下进行，以避免外源性DNA的污染。
在实验前，所有的器材和试剂瓶口都必须经过高温消毒，或使用酶切酶或DNase去除潜在的污染。
实验操作步骤实验操作步骤是PCR实验中最关键的部分，任何疏忽都可能导致实验失败或产生虚假结果。
以下是PCR实验中的一些重要操作步骤。
1.反应体系的配制PCR反应体系通常包括引物、模板DNA、dNTPs、聚合酶和缓冲液等组分。
根据实验需要，在计算器或试剂盒说明书的指导下，计算和配制所需的每个组分的量。
2.反应管的装填和密封将配制好的PCR反应体系分装到PCR反应管中，并在反应管盖上加上适当的密封层，如矿物油或矽胶珠。
这样可以防止反应体系的蒸发和污染。
3.反应条件的优化PCR反应需要针对性地进行优化，包括反应温度、循环数和延伸时间等参数。
通过合理调整这些参数，可以最大限度地提高PCR扩增的效率和特异性。
4.防止污染和交叉污染PCR反应对DNA污染非常敏感，因此需要特别注意防止样品之间的DNA 交叉污染。
pcr 操作中最应该注意的事项
pcr 操作中最应该注意的事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
在进行PCR操作时，有一些非常重要的事项需要特别注意，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是在PCR操作中最应该注意的事项：1. 实验室操作规范：在进行PCR操作之前，需要做好实验室操作规范的准备工作，包括戴好实验手套、穿好实验服、清洁操作台面等。
避免在实验室中进食、饮水或使用手机等。
2. 检查实验仪器和试剂：在开始PCR实验之前，需要确保PCR仪器的正常运转和试剂的完整性。
检查PCR仪器的温控系统、离心机的转速、试剂的保质期等，确保实验条件的准确性。
3. 建立阳性和阴性对照：在每次PCR实验中，都要包括阳性对照和阴性对照，以验证实验的准确性。
阳性对照应包括已知的阳性样品，而阴性对照则应该是未添加DNA模板的反应混合物。
4. 采用单独的PCR实验室：为了避免PCR实验中的污染，最好在专门的PCR实验室中进行实验，避免与其他实验室中的DNA样品混合。
5. 严格控制实验条件：在PCR实验中，需要严格控制实验条件，包括温度、时间、试剂比例等。
确保PCR反应体系的均匀混合、温度梯度的准确性和反应时间的精确控制。
6. 避免污染：PCR实验非常容易受到外源DNA的污染，因此需要避免在实验室中的DNA样品和PCR产物的交叉污染。
实验中应该使用滤器枪头、一次性试剂盒等措施，避免污染的发生。
7. 定期维护PCR仪器：PCR仪器的维护对实验的准确性非常重要。
定期清洁PCR仪器的加热盖、检查温度控制系统的准确性、更换磁力搅拌器的磁子等，确保PCR仪器的正常运转。
8. 标记实验样品：在进行PCR实验时，需要对实验样品进行正确的标记，包括样品的编号、实验日期、PCR程序名称等。
避免实验样品的混淆和实验结果的不准确。
9. 注意PCR产物的保存和处理：PCR产物的保存和处理对实验结果的可靠性有着重要的影响。
PCR操作过程中的注意事项
PCR操作过程中的注意事项PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。
在进行PCR实验时，需要特别注意以下几个方面，以确保实验的成功和准确性。
实验室准备在进行PCR实验之前，需要准备一个干净整洁的实验室环境。
实验台面和操作工具应经过彻底清洁和消毒，以防止外源性污染。
此外，实验室应具备相应的PCR工作区，以便进行样品准备、试剂配制和扩增反应。
样品处理在处理样品前，应注意避免自身和外源性DNA污染。
实验人员应保持良好的个人卫生习惯，并佩戴手套、口罩和实验外套。
样品处理区应与其他区域隔离，并使用专门的试剂和工具，以防止交叉污染。
反应管选择和处理选择高质量的PCR反应管以确保准确的结果。
反应管应具有良好的耐热性和密封性。
在使用反应管之前，应检查是否有破损或污染。
使用无RNase/DNase酶的反应管，并在实验过程中避免接触皮肤和外源性RNA/DNA。
试剂配置和操作PCR试剂应根据厂家说明进行配置和操作。
重量和体积的测量应精确，并使用纯净的洗净水或无核酸酶的溶剂溶解试剂粉末。
如有需要，可以使用过滤器或离心机去除可能的污染物。
扩增反应条件PCR反应的成功与否取决于反应条件的优化。
实验人员应根据模板DNA的特性和扩增片段的大小选择合适的引物、试剂浓度和温度。
为了避免非特异性扩增，温度梯度PCR或优化的程序温度是必不可少的。
工作流程严谨在进行PCR实验时，应遵循严谨的实验流程。
准确记录每一步操作，包括试剂配制、样品处理、扩增反应条件和时间。
要尽量避免温度变化和长时间暴露，以防止DNA 降解和酶的活性损失。
阴性对照和负对照为了排除污染、引物非特异性扩增和假阳性的可能，实验中应设置阴性对照和负对照。
阴性对照是在反应中添加无模板DNA的反应管，负对照是在反应中不添加任何试剂。
通过与实验组的对照组比较，可以确定实验结果的准确性。
PCR产物处理在PCR反应后，应根据实验目的选择合适的PCR产物处理方法。
可以通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切、测序等技术进行PCR产物的检测和分析。
PCR注意事项
PCR注意事项
1.用过的抢要调回最大值，用完装枪头的盒子要记得盖上。
2.红色PCR仪用的是平头的管子，白色PCR仪用的是凸头的管
子。
3.设置的程序可以标为自己的名字，储存在PCR仪中，下次使
用时调出即可。
PCR仪使用要登记。
4.无菌水存于-20°，Buffer和镁离子可以放在自己的盒子里，
Taq酶由张仰齐保管（保管半年），用时找他拿，用后要登记，dNTP为公用，存于-20°。
引物BOSS设计好由生工合成，自己的引物自己保管，一般需要将引物稀释若干倍使用。
5.连续使用PCR仪，中间间隔时间不少于半小时，供设备休息。
6.如果不是要回收的片段不必非要用新胶，旧胶即可，电泳完
毕记得关闭电泳槽的电源，观察完毕后将旧胶扔进指定的袋子，其他物件归位
PS: 温馨提示大家，电泳后如果带型好，要及时拍照，做到有图有真相，以后的数据和图片也要及时保存，非常重要。
pcr实验中的注意事项
pcr实验中的注意事项PCR 实验中的注意事项PCR（聚合酶链式反应）实验是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于扩增特定的 DNA 片段。
在进行 PCR 实验时，有许多注意事项需要牢记，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前的准备1、设计合适的引物引物的设计是 PCR 实验成功的关键之一。
引物的长度一般在 18 25 个碱基之间，GC 含量应在 40% 60%之间，并且要避免引物自身形成二级结构和引物之间的互补。
可以使用在线引物设计软件来辅助设计，但设计完成后需要进行仔细的评估和验证。
2、准备高质量的模板 DNA模板 DNA 的质量和纯度对 PCR 结果有很大影响。
DNA 应尽量纯净，避免蛋白质、RNA 等杂质的污染。
可以使用 DNA 提取试剂盒来提取 DNA，并通过分光光度计测量其浓度和纯度。
3、选择合适的 PCR 试剂包括 DNA 聚合酶、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）、缓冲液等。
不同的 DNA 聚合酶具有不同的特性，如保真度、延伸速度等，应根据实验需求进行选择。
dNTPs 的浓度要合适，过高或过低都会影响 PCR 反应。
缓冲液的成分和 pH 值也会影响反应的效率。
4、准备干净的实验器具PCR 实验对污染非常敏感，因此使用的移液器、离心管、PCR 管等器具都要经过严格的清洗和灭菌处理，以避免外源 DNA 的污染。
二、实验中的操作1、严格控制反应体系的配制按照实验方案准确地加入各种试剂和模板 DNA，注意移液器的使用规范，确保加样的准确性和一致性。
在加样过程中，要避免试剂和模板的交叉污染。
2、设置对照实验对照实验对于判断 PCR 结果的可靠性非常重要。
常见的对照包括阳性对照（含有已知目标 DNA 片段的样品）、阴性对照（不含目标DNA 片段的样品）和无模板对照（只含反应试剂而不含模板 DNA 的样品）。
通过对照实验，可以检测试剂是否污染、反应体系是否正常以及是否存在非特异性扩增等问题。
PCR实验操作注意事项
操作注意1.冻结制品融解后请上下颠倒轻轻均匀混合，避免振荡器等剧烈搅拌。
混匀制品后请用离心机轻微离心后使用。
2.本制品使用前请于-20℃保存，使用后请立即保存于-20℃。
3.尽量避免多次反复冻融，如果需要多次使用时，请在第一次融解后将制品按适当量分装后保存。
4.本制品中不含有荧光探针、荧光染料等。
5.反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。
6.在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性薄壁进口200μl PCR管、移液器头(带滤嘴自卸式)，不能用手直接触摸PCR反应管。
7.操作台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸钠及/或70%乙醇擦拭消毒。
实验房间、超净工作台应定期及每次实验后用紫外灯处理。
8.试剂盒请在保质期内使用。
9.配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。
10.实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。
11.荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。
12.配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，避免产生气泡。
反应体系配制完毕后低速离心数秒，立即进行PCR扩增。
●Real Time PCR操作顺序1.溶解试剂，上下颠倒混匀，确认溶液完全溶解。
注）避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。
长时间室温放置会降低制品性能。
2.按照说明书计算其余各组分的用量。
3.配制PCR反应用混合液，分装至PCR反应管中。
4.添加PCR扩增用模板。
5.使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。
注） 1. 反应液配制方法和PCR扩增条件请参照使用方法。
2. Real Time PCR仪的使用方法，请参照各种仪器说明书。
3. 50℃ 2分钟→95℃ 20分钟这两步用于消除扩增产物片段污染，灭活UNG酶和进行热启动Taq 酶。
验证PCR注意事项
验证PCR注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种被广泛应用的基因检测技术，可以在短时间内扩增小片段DNA，使其数量快速增加。
然而，PCR技术操作繁琐，在实验过程中存在许多需要注意的事项，下面我将详细回答并讨论PCR技术的注意事项。
1. 实验室准备：在进行PCR实验前，要充分准备实验室所需的基本设备和试剂，如PCR仪、热循环程序控制器、离心机、PCR试剂盒等。
还需要保证空间干净整洁，避免交叉污染。
2. 基因组DNA提取：PCR反应的第一步是提取样本中的DNA，注意要选择适当的提取方法。
常用的方法有酚/氯仿法、磁珠法、硅胶膜法等，具体选择取决于样本类型和实验目的。
此外，提取过程中要避免样本的污染，严格遵守操作规程。
3. 靶标序列选择与设计：设计引物是PCR反应成功的关键。
引物应与目标DNA序列互补，长度在18-30碱基之间，GC含量约为50-60%。
引物间应该没有互补碱基片段，以避免引物二聚体的产生。
在设计引物时，可以利用一些在线工具进行引物评估，确保引物的特异性和稳定性。
4. 引物浓度的优化：引物浓度的优化对PCR反应的成功与否至关重要。
引物过多会导致引物二聚体或非特异性扩增，引物过少则可能导致不稳定的扩增。
一般来说，引物的最佳浓度为0.1-0.5μmol/L。
5. PCR反应体系的优化：PCR反应体系主要包括引物、DNA模板、dNTPs、聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
体系中各个组分的浓度和比例需要优化，以确保PCR反应的成功。
一般来说，每个PCR反应管中最终反应体积为20-50μl，引物浓度为0.2-0.5μmol/L，模板DNA浓度为10-200ng。
6. 热循环程序设置的优化：PCR反应的关键步骤是反应体系的热循环程序。
温度和时间的设置需要根据引物和目标序列的特性进行优化。
常规的PCR热循环程序包括：变性（94-98C）、退火（50-68C）和扩增（72C）等步骤，反应周期数一般为25-40个。
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PCR注意事项PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。
1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。
室温保温1小时，或4℃过夜。
在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。
少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。
为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。
用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。
培养过夜，产生1000个菌落。
转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。
具体而言转化用10ng DNA，用SOC 稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。
转化率为：1000克隆X10（3次方）ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。
可能是连接酶污染了核酸酶。
T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。
为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。
如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。
如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。
用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。
UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy 载体克隆所需。
加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
详情查pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。