稀少精子冷冻技术
实验室常用猪精液的低温保存方法
实验室常用猪精液的低温保存方法
一、冷冻保存
冷冻保存是猪精液最常见的保存方法之一。
在冷冻保存之前，需要对猪精液进行初步处理。
需要保持猪精液的干净和纯净，避免杂质的混入。
将处理好的猪精液放入专用的冷冻管中，然后将冷冻管放入冷冻盒中。
接着，将冷冻盒放入专用的冷冻机中，进行冷冻保存。
在冷冻保存的过程中，需要控制温度和湿度，避免冷冻温度过高或者过低，以免影响猪精液的质量。
冷冻保存方法能够长时间保存猪精液，并且保持猪精液的活力和质量，适用于长时间保存和远距离运输。
二、液氮保存
液氮保存方法能够更好地保持猪精液的质量和活力，可以长时间保存，并且适用于大规模的保存和长时间的保存需求。
液氮保存需要特殊的设备和条件，并且保存、运输和使用过程中需要更加小心谨慎，否则会影响猪精液的质量。
三、干冰保存
干冰保存是一种中等程度的低温保存方法。
在干冰保存之前，同样需要对猪精液进行初步处理。
然后将处理好的猪精液装入专用的干冰盒中，接着将干冰盒放入专用的冷冻设备中进行保存。
干冰保存方法能够较长时间地保存猪精液，并且适用于一般实验室的保存需求。
它比液氮保存更为便捷和易行，但是保存时间相对较短。
实验室常用猪精液的低温保存方法有冷冻保存、液氮保存和干冰保存等多种方式。
不同的保存方法适用于不同的实验需求和实际情况，实验室人员需要根据实际情况进行选择和使用。
在保存猪精液的过程中，需要注意保持猪精液的纯净和完整，控制保存温度和湿度，以及避免受到外界因素的影响，以确保保存的猪精液的质量和活力。
希望本文对实验室人员在猪精液保存方面有所帮助。
鸡精液保存技术的研究进展
572023.6中，能够促使鸡蛋的蛋黄沉积并降低其病死率。
在獭兔日粮中分别添加0.1%、0.15%复合酸化剂，獭兔腹泻率和死亡率明显下降。
随剂量的增加，复合酸化剂对肉兔的生长性能和病死率的作用接近抗生素的效果。
3 复合酸化剂对猪生产性能的影响3.1 复合酸化剂对猪生长性能和腹泻率的影响在猪自由采食时，猪的采食量直接影响其生长性能的高低。
许多报道显示，复合酸化剂可以提升日粮的适口性，采食量增加。
研究者在断奶仔猪中添加0.15%酸化剂，其日增重有所增加，腹泻率下降22%。
研究人员在断奶仔猪饲料中添加不同酸化剂，显示酸化剂在提升生长性能和降低腹泻率方面有显著影响。
3.2 复合酸化剂对猪肠道微生物的影响在酸性条件下，致病菌的生长受到一定抑制，有益菌增殖速度较快。
有报道，将不同的有机酸添加至仔猪的日粮中，各组产气荚膜杆菌和大肠埃希菌的增殖均受到抑制。
饲喂酸化剂后，检测仔猪粪便，沙门氏菌和大肠埃希菌数量明显减少，乳酸菌含量约为复合抗生素组的2倍。
将0.2%山梨酸添加至母猪日粮中，对仔猪哺乳期窝重有促进作用。
产前7日在母猪日粮中添加丙酸、乙酸复合酸化剂，对哺乳期三元杂交母猪采食量无明显改善，但2000毫克/公斤组蛋白质消化率高于对照组3.43%。
3.3 复合酸化剂对猪免疫功能的影响猪血清中血清总蛋白、白蛋白和球蛋白可以反映蛋白质代谢水平与猪机体健康状况。
投喂复合酸化剂的仔猪，血清中白蛋白含量显著增加。
研究表明，仔猪日粮中添加0.1%复合酸化剂后，显著提高血清总蛋白和球蛋白水平。
研究显示，饲喂添加酸化剂后，仔猪血液IgG水平显著提升，但IgM含量无显著变化。
由柠檬酸、甲酸、苯甲酸、磷酸、富马酸、甘蔗糖蜜、乙酸和丙酸制成的复合酸化剂组与复合抗生素组相比，血清IgM含量提高34.8%，提升断奶仔猪的免疫功能。
3.4 复合酸化剂对母猪初乳品质的影响在新生仔猪的生长过程中，初乳的免疫作用极其重要。
新生仔猪体内能力储备量少，其应对环境的变化，需耗费大量能量，新生仔猪断奶前能量来源为母乳，母乳品质高低对仔猪成活率产生直接影响。
精液冷冻储藏技术掌握精液收集处理和储存的方法
精液冷冻储藏技术掌握精液收集处理和储存的方法精液冷冻储藏技术是一项重要的生物技术，它可以帮助人们保存和储存精液。
无论是用于人类繁殖技术还是动物繁殖技术，精液冷冻储藏技术都发挥着重要的作用。
本文将介绍精液收集、处理和储存的方法。
一、精液收集方法精液的收集是精液冷冻储藏的第一步，它要求采用合适的方法来保证收集到高质量的精液样本。
1. 人类精液收集方法:人类精液的收集通常采用自慰法。
收集器宜选用干净的容器，确保不会对精液样本产生污染。
在收集的过程中，应保持良好的心态和放松的状态。
2. 动物精液收集方法：动物的精液收集可采用人工授精法、人工阴道法等多种方法。
具体方法需要根据不同动物的特点来确定。
二、精液处理方法精液的处理是为了去除其中的杂质，提高精液的质量。
1. 离心法：通过离心分离法，可以将精液中的不碳水化合物、细胞和其他杂质去除，提高精液的纯度。
离心的速度和时间需要根据精液的浓度和特性来确定。
2. 过滤法：通过过滤器过滤精液，使其中的颗粒和污染物被过滤掉，确保精液的干净和纯度。
三、精液储存方法精液储存是精液冷冻储藏技术的最后一步，它是为了确保精液的长期保存和保存质量。
1. 液氮储存：液氮储存是当前最常用的精液储存方法之一。
将处理好的精液样本放入液氮罐中，保持温度在零下196摄氏度，确保精液的长期保存。
2. 冷冻储存：冷冻储存是另一种常用的精液储存方法。
将处理好的精液样本放入冷冻管中，通过快速冷冻和在低温下保存，确保精液的保存质量。
总结：精液冷冻储藏技术是一项重要的生物技术，它可以帮助人们保存和储存精液，无论是用于人类繁殖技术还是动物繁殖技术。
在进行精液冷冻储藏之前，需要准确掌握精液收集、处理和储存的方法。
精液冷冻储藏技术的正确应用将对人类和动物的繁殖事业产生积极的影响。
实验十五精液的冷冻保存
实验十五精液的冷冻保存一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：3～4人二、实验目的要求精子具有受温度变化直接影响本身活动力和代谢能力力的生物学特性。
利用这一特性，将精液特殊处理后，保存在超低温下，精子代谢活动完全受到抑制，停止能量消耗，处于生命静止状态，长期保存下来。
一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
要求同学们了解精液冷冻保存的技术操作过程和精液冷冻保存原理，初步学会冷冻保存方法。
三．实验原理冰晶化是水在降温过程中的一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶。
冰晶可造成精细胞（精子）内外的溶质浓度和渗透压增高，引起细胞内脱水、原生质变干、酸碱失去平衡、细胞膜和顶体以及整个组织和结构破坏等致死性伤害，最后导致精子发生不可逆的变化而死亡。
一般精液内含85%～95%的水分，精子内也含有及少量的水分，这些水分在降温过程中在-0.6～-60℃温度区内缓慢降温能形成冰晶。
降温速率越慢，所形成的冰晶越大，其中特别以-15～-25℃时冰晶形成最多。
在冷冻精液过程中只有避开这个有害温度区，才能得以长期保存。
快速升降温度的办法，难以达到完全玻璃化冻结条件。
为此，在制作冷冻精液的稀释液内，要加入一定量的甘油等抗冻害物质。
甘油具有极强的亲水性，可限制水分子形成冰晶而处于过冷状态，降低水形成冰晶的温度，即缩小精子的有害温度的上限。
此外甘油容易渗透精子内，可降低渗透压改变的不良影响及营养作用等，增强精子的抗冻害能力和无冻害生存环境。
精液在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶，精子能否生存的关键在于冰晶的大小，冰晶越大对精液伤害越大，反之冰晶越小，伤害越小甚至无损伤。
因此，只要避免大冰晶形成，并使精子稳定在微晶的状态下，一旦升温精子又能复苏并维持其原来的受精能力。
四．实验材料和仪器精液、2.9%的柠檬酸钠溶液、50～100ml烧杯、滴管、10 ml试管、低温温度计、20～80目纱网、漏勺、灭菌纱布袋、液氮罐、液氮、载玻片、盖玻片、显微镜、保温箱。
精液的冷冻保存课件(共21张PPT)《畜禽繁殖与改良》
小结
精液冷冻保存的意义
精液的冷冻保存
精液冷冻保存原理精液冷冻技术Fra bibliotek液态→固态
结晶态：缓慢降温形成。水分子有序形成 冰晶对精子有害：机械和渗透压损伤。
（0～-60℃ ）（ -15～-25℃）
玻璃态：快速降温形成。水分子无序形成 玻璃样的超微粒结晶，对精子无害
（ -60～-250 ℃ ）
• 玻璃化是可逆的，不稳定的，当缓慢升温时又可能形成冰晶化。
3精液冷冻技术
8
三、精液冷冻技术
2精液冷冻保存的原理
5
二、精液冷冻保存的原理
利用超低温使精液和精子快速冷冻，快速越 过形成冰晶的温度范围（0～-60 ℃）、精液或 精子中的水分不形成冰晶，而是形成玻璃化。同 时在抗冻剂的存在下使精子免受冻伤，在温度上 升至体温精液解冻后精子能够保持完整的形态结 构、功能和受精能力。
二、精液冷冻保存的原理
0.08亿÷0.25mL=0.32亿/mL 细管冻精精子密度为：
0.32亿/mL÷0.35亿/mL=0.914亿/mL 稀释倍数为：
13.8亿/mL÷0.914亿/mL≈15(倍)
三、精液冷冻技术
➢ 精液稀释 • 稀释液的配制
三、精液冷冻技术
精液稀释
两次稀释法：缩短甘油与精子接触的时间，甘油添加量5%-7%
三、精液冷冻技术
精液分装
0.25mm细管冻精
精液分装机
三、精液冷冻技术
冷冻精液
三、精液冷冻技术
冷冻精液
三、精液冷冻技术
活率检查
冻精解冻
细管型：直接将其投入到38-40℃的温水中，待冻精融化到一半时，立即取出备用。
三、精液冷冻技术
保存精液
冷冻精液技术的研究
冷冻精液技术的研究作者：刘新娥来源：《农业开发与装备》 2012年第6期刘新娥（新疆阜康市职业中等专业学校，新疆阜康 831500）摘要：品种改良必须有良法，俗话说“母畜好，好一线，公畜好，好一坡”，这充分说明了公畜在繁殖改良中的重要作用。
冷冻精液和人工授精（AI）的推广，就可以大大提高优良种畜的使用价值。
在我国20世纪30年代就开展了人工授精技术，70年代中期进行了冷冻精液的研究。
家畜冷冻精液研究的成功，使人工授精技术又有了新的发展。
冷冻精液不受时间、空间和种畜寿命的限制，可以最大限度地发挥优良种畜的作用。
因此，人工受精技术就成了一门全新科学技术，冷冻精液技术就至关重要。
关键词：精液品质；稀释液；冷冻精液1 精液品质的鉴定1.1 鲜精质量评定1.1.1 肉眼。
从射精量、稠度、颜色、气味、异物等方面进行评定精子。
1.1.2 显微镜。
（1）精子活率：直线向前运动精子百分率一般在0.7～0.8左右，不低于0.6。
（2）精子密度：A、估测法，粗略分为“密”“中”“稀”三级，但有赖于检查者经验有一定的主观性，误差较大。
B、血细胞计计数法，使用血细胞板，可准确的测定每单位容积精液中精子数。
1.2 冻精质量评定在某一天冷冻精液，要在冷冻当天和冷冻后第14天解冻检评。
抽检两次仍低于标准，整批冻精将被弃去。
冻精出售还要进行最后一次检评。
冻精活力按国际标准不得低于0.3，每份冻精有效精子数不得少于1200万。
另外，对顶体完整率和细菌指标都有严格的规定。
2 精液稀释和稀释度目前牛冷冻精液所用稀释液，有70%的国家使用20%卵黄一三基缓冲液；20%是牛奶卵黄稀释液；10%卵黄—乳糖液制作颗粒。
2.1 精液稀释目的1）扩大精液容量；2）通过降低精液能量消耗，补充适量营养和保护物质，延长精子的寿命；3）便于精子保存和运输.2.2 精液稀释液的主要成分及其作用2.2.1 稀释剂。
主要用来扩大精液容量。
因此，此种物质的剂量，必须与精液有相同的或相似渗透压。
《精液的冷冻保存》课件
冷冻保存的精液可以用于帮助亲属实现生育，提供了一种救命的选择。
冷冻保存的优势
保质期长
精液在低温环境下可以保存多 年，保持生育能力的质量。
高成功率
冷冻保存的精液在解冻后可以 仍然保持较高的受精能力，提 供了较高以根据需求 随时取用，方便灵活。
冷冻保存的步骤
《精液的冷冻保存》
精液的冷冻保存是一种先进的技术，可以帮助人们实现生殖自主。了解冷冻 保存的原理和方法对于对生育计划有影响的人群来说尤为重要。
冷冻保存的需求
1 生育自主权
冷冻保存提供了人们保留生育能力的方式，为其日后的生育计划提供了灵活性。
2 医学治疗
一些医学治疗方案可能对生育能力造成不可逆的损害，冷冻保存可以帮助人们在治疗前 保留生育的可能性。
结语
冷冻保存技术的发展为许多人提供了实现生育愿望的机会。了解冷冻保存的 优势和步骤，将有助于人们做出明智的生育决策。
生殖技术实验室
生殖技术实验室使用冷冻保存技 术作为其研究和治疗的基础。
冷冻保存的前景
科学进步
随着科学技术的不断发展，冷冻保存技术也将不断提高，为更多人带来福音。
社会认知
人们的生育观念正在逐渐改变，冷冻保存技术的认知度将逐渐提高。
政策支持
许多国家和地区已经意识到冷冻保存的重要性，将提供相关政策和支持。
1
检测评估
对精液进行检测和评估，确保其质量符合保存要求。
2
冷冻处理
采用特定的技术将精液在低温下快速冷冻，使其保持生育能力。
3
保存管理
将冷冻好的精液储存到特殊的冷冻设备中，并进行管理和跟踪。
冷冻保存的应用
生育诊所
冷冻保存的精液在生育诊所中应 用广泛，帮助人们实现他们的生 育目标。
精子的简易保存方法
精子的简易保存方法
精子的保存方法可以分为两种：长期保存和短期保存。
短期保存方法：
1. 使用特制的精子保存液：在实验室或生育技术中心，精子可以使用特制的精子保存液进行短期保存，如液氮冷冻保存液。
2. 阴囊内保存：男性可以将精液保存在阴囊内，阴囊的温度比体温低一些，有助于延缓精子的新陈代谢，但此方法只适用于短期保存，不能超过数小时。
长期保存方法：
1. 冷冻保存：精子可以被冷冻并存放在液氮罐中，通常使用特殊的冷冻保存液保护精子的质量。
这种方法能够长期保存精子，但需要專業的冷凍保存设备和技术。
2. 冷冻干燥保存：精子可以冷冻干燥并封装在密封容器中，以在较长时间内保持稳定。
这种方法也需要专业的设备和技术。
无论使用哪种方法，精子保存前需要经过初步的处理，如去除其他液体和不健康的精子，以保持保存的精子的质量和活力。
精子保存的有效期根据保存方法的不同可以从数小时到数十年不等，建议咨询专业的医生或生殖技术专家获得更详细的指导。
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稀少精子冷冻技术
薛松果
临床应用价值高：
男方因素约占不孕症病因的30-40％，无精症约占男方因素的10％左右。
1992年Palermo等首先将卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术应用于临床，解决了男性严重少、弱、畸形精子症患者不能生育子代的难题。
而ICSI技术结合显微外科取精术如附睾精子抽吸术(microsurgical epididymal sperm aspiration，MESA)、经皮附睾穿刺取精术(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和睾丸精子抽取术(testicular sperm extraction，TESE)则使无精症患者养育遗传学子代成为可能。
然而，MESA、PESA和TESE等都是创伤性手术，多次反复手术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，在女方采卵当日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。
技术难度大：
但是，传统的精子冷冻采用 1.8mL的冷冻管(Cryovial)或0.25－0.5mL麦管(Straw)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程还需要对精子作2-3次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。
而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。
现状：
自Jacques Cohen等报道用空透明带作为载体进行人单个精子冷冻以来，有多个载体被报道可用于单个或稀少精子的冷冻保存，如ICSI注射针、冷冻环（Cryoloop）、Cryotop、Cell Sleeper等等。
但截至目前，尚没有一个理想的、简单、高效的方法和载体用于人辅助生殖临床上对无精症患者穿刺获得的精子进行冷冻保存。
九院特色：
自2010年开始，九院就尝试用自制的冷冻片Strawtop冷冻睾丸/附睾穿刺精子，并先后申请了两项稀少精子冷冻（含单个精子）方面的专利，我们的经验是，一个好的、适合在临床上推广使用的（不仅仅是研究用）稀少和单个精子冷冻的技术，应该满足三个条件：1 回收率高，这是前提，没有高回收率则会导致复苏后精子数量不足，而取消ICSI治疗周期，或被迫做卵子冷冻（该技术目前并不成熟，冷冻卵子的使用效率仅为新鲜卵子的50-60%）。
2 复苏存活率高，这是关键，要尽可能提高稀少和单个精子复苏后的存活率。
3 易于使用、可及性强，临床技术人员是否愿意使用对一个技术方法的推广至关重要。
九院已有成绩：
2009年3月18日-2015年12月31日
558人次，2960支，5.3支/人/次
附睾穿刺93人次，睾丸穿刺316人次，睾丸切开47人次，精液102人次。
九院方法：
九院用自制冷冻片Strawtop对穿刺获得的稀少精子进行冷冻保存，与传统的麦管法相比，二者复苏精子的受精率、优质胚胎率、临床妊娠结局等均无差异，但该方法可以大大降低无精子患者反复穿刺的发生率，在诊断性穿刺手术日对穿刺获得的精子进行冷冻保存，极大避免取卵日无精子可用的情况发生。
该方法在本科室已经成功应用了5年。
冷冻
解冻：
匡延平，彭秋平。
精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置。
申请号：200810042695.4，主分类号 C12N5/08(2006.01)I，分类号：C12N5/08(2006.01)I C12M3/00(2006.01)I，公开号：101671651，公开日：2010-03-17
薛松果，彭秋平，曹少峰，匡延平。
一种微量精子冷冻保存载体。
申请号或专利号：201520322730.3
Songguo Xue, Qiuping Peng, Shaofeng Cao, Qiao Y u, Jiqiang Si, Yanping Kuang*, Cryopreservation of a small number of human spermatozoa with home-made Strawtop: 3 years experience, The 2nd World Congress on Fertility Preservation, Miami USA, 2011.12.08-10, Journal of assisted reproduction and genetics, 28, 991-992.
Qiu-Ping Peng, Shao-Feng Cao, Qi-Feng Lyu, Song-Guo Xue*, Wei Jin, Xiao-Yin Liu,Wen-Jie Zhang, H. Ingolf Nielsen, Yan-Ping Kuang, A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa, In Vitro Cellular & Developmental Biology –Animal, 47(8), 565-72, 2011。