第十节 基因工程药物制造实例
生物制药工艺学 基因工程制药
三 PCR法直接克隆基因
? PCR-- 多聚酶链式反应 (Polymerase chain reaction)
? PCR 是一种模拟天然 DNA 复制过程，在有 DNA模板、 DNA 聚合酶、引物和四种 dNTP 的情况下，通过高温 变性 （90℃-95 ℃)退火， 延伸这样反复循环的过程，在体外扩增特异
? 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；
? 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、
集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血
因子； ? 激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； ? 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织
型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化
酶。
基因工程技术生产药品的优点：
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白
连接成完整的基因。
化学合成基因的限制：
? 不能合成太长的基因。最长50-60 bp ，只适 用于克隆小分子肽 的基因。
? 人工合成基因时， 遗传密码的简并 会为选 择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序 推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然 基因不完 全一致，易造成中性突变。
? 费用太高。
六 对旧基因的改造
第三节 目的基因的获得
克隆基因的常用方法：? 基因组法（原核） ? 反转录法（真核）? PCR法（原核 +真核） ? 反转录-聚合酶链反应法（真核） ? 化学合成法（原核 +真核）
? 旧基因改造法（原核enomic DNA）：指代表一个细 胞或生物体整套遗传信息 （染色体及线粒体） 的所有DNA 序列 。
PCR 原理示意图
四 反转录-聚合酶链反应法
反转录与聚合酶链反应（ PCR）结合的方法： mRNA 经反转录合成 cDNA 第一链后，不再 合成 cDNA 第二链，而是在特异引物协助下， 用PCR方法 进 行扩 增 ，特异地合成目的 cDNA 链。
〖医学〗基因工程药物的质量控制
检测方法
鲎试剂、家兔热原法 免疫分析、SDS-PAGE、CE 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤
〖医学〗基因工程药物的质量控制
宿主细胞中表达的外源基因， 在转录翻译精制工艺放大过程 中都可能发生变化，故从原料 以及制备全过程都必须严格控 制条件和鉴定质量。
一、 原材料的质量控制
原材料的质量控制是确保编码 药品的DNA序列的正确性，重组微 生物来自单一克隆，所用质粒纯而 稳定，以保证产品质量的安全性和 一致性。
在重复生产发酵中，工程菌表 达稳定；
始终能排除外源微生物污染。
生产基因工程产品应有种子 批系统，并证明种子批不含有致 癌因子，无细菌、病毒、真菌和 支原体等污染，并由原始种子批 建立生产用工作细胞库。
原始种子批须确证克隆基因 DNA序列，详细叙述种子批来源、 方式、保存及预计使用期，保存 与复苏时宿主载体表达系统的稳 定性。
⒌产品一致性的保证
五、产品的保存 ⒈液态保存 ⑴低温保存 ⑵在稳定的下保存 ⑶高浓度保存 ⑷加保护剂保存 ⒉固态保存
第十节 基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种 活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性， 是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性 的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分 为α1b α2a α2b等亚型。
弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （肺血 液血小 板红血 球白血 球）， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。（ 肺炎青 霉素肝 炎）
基因工程药物制造实例
1
基因克隆
将感兴趣的基因从源细胞中分离并扩
基因表达
2
增。
将克隆的基因导入表达系统，如细胞
或微生物，使其表达目标蛋白质。
3
纯化和制备
从表达系统中提取和纯化目标蛋白质， 并进行进一步的制备和处理。
实例一: 重组蛋白药物
重组蛋白药物通过基因工程技术制造，包括利用重组DNA将目标基因导入宿 主细胞，并使其表达和产生所需蛋白质。
遗传性疾病
基因治疗和基因编辑药物可以治疗一系列遗传性疾病，如囊性纤维化和遗传性失明。
免疫疗法
利用基因工程药物的方法增强机体免疫力，如CAR-T细胞疗法用于白血病的治疗。
未来发展趋势和挑战
随着科技不断进步，基因工程药物将在治疗领域发挥越来越重要的作用。然 而，挑战包: 基因治疗药物
基因治疗药物利用基因工程技术将正常基因导入患者体内，修复异常基因， 以治疗遗传性疾病或慢性疾病。
实例三: 基因编辑药物
基因编辑药物利用基因工程技术对患者体内的基因进行直接编辑或修饰，以治疗一些疾病或改善基因特 性。
基因工程药物的应用领域
癌症治疗
通过基因工程技术开发出的靶向治疗药物可以有效抑制癌细胞生长和扩散。
基因工程药物制造实例
从基因工程药物的定义和背景知识开始，介绍基因工程药物制造的实例及其 应用领域，并探讨未来发展趋势和挑战。
基因工程药物定义和背景知识
基因工程药物是通过人工改变或调整基因来制造的药物，利用生物技术的手 段来生产和开发。它们具有高度的精准性和特异性，可以用于治疗各种疾病。
基因工程药物的制造过程
基因工程制药
2/穿梭载体/克隆载体/分泌型表达载体/精确表达载体/基因 工程/PCR/
1. 原核细胞：3种 2. 真核细胞：3种 以上各宿主的特点是什么？
二、大肠杆菌中的外源基因表达
1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质 2. 2个表达载体——pBV220 & pET system 3. 影响目的基因表达的5大因素 4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式
三、外源基因在酿酒酵母中的表达
粒转化大肠杆菌细胞； d．培养大肠杆菌，让重组质粒
及外源目的基因形成大量拷 贝； e．筛选含重组质粒的大肠杆菌 细胞，进行检查或鉴定。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切和电泳方法
琼脂糖凝胶电泳 分离鉴定大小不 等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻
力 ——不同迁移率 分子量标准参照物
限制性酶切位点的序列，即多克隆位点
d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
pUC118 质粒的 多克隆位 点整合在lacZ基因中，该位点 如果没有插入外源目的基因， lacZ基因便可表达出半乳糖 苷酶，如果平板培养基中含有 IPTG 和 X-gal ， X-gal 便 会 被 半乳糖苷酶水解成兰色，大肠 杆菌形成蓝色克隆。
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一 个质粒可以大量增加其拷贝数。
细菌质粒pUC18
a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复
制形成大约500个拷贝。 c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种
生物制药工程：第二章 第十节 案例教学 基因工程菌生产人胰岛素 定稿
基因工程菌生产人胰岛素
教学 内容 重点讲述胰岛素的三种表达方法
教学 目的
通过本章节的学习，使学生对整 个基因工程制药的流程有个清晰 的认识。
基因工程菌生产人胰岛素
1
胰岛素的发现
2
胰岛素的结构
3
胰岛素类型
4
人胰岛素的生产方法
胰岛素的发现
我国古代将糖尿病称为“消 渴症”，例如唐朝初期的医书上 有这样的记载：“渴而饮水，小 便数… …甜者，皆是消渴症也。” 充分说明，这些病人老是感到口 干想喝，排尿特多，而排出的尿 呢，其甜无比。
评
为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司
价
随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
人胰岛素的生产方法
（2）人胰岛素原表达法
基 因 工 程 菌 的 Apr 构 建 策 略
tac Met
β-Gal
转化
Met
B peptide C peptide A peptide
ori M
人胰岛素原的cDNA
M B链 C
产
CNBr处理
物
的
N
CN C
N CN
C
后
处
分离纯化
Cys体外氧化和重折叠
理
线
路
N
N
SS
| S | S |
C
| S
S
|
C
人胰岛素的生产方法
（1）A链和B链分别表达法
生
由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，
产 体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%～
技 20%，因此采用这条工艺线路生产的重组人胰岛素 术 的 每克成本高达100美元以上。
论述基因工程药物制造过程的主要程序,并举例说明
论述基因工程药物制造过程的主要程序,并举例说明嘿，朋友！咱今天来聊聊基因工程药物制造这神奇的事儿。
你知道吗，基因工程药物制造就像是在一个神秘的实验室里搭建一座超级精细的积木城堡。
首先，得找到那关键的“基因积木”，这就好比在茫茫大海里捞到那根定海神针。
科研人员要从各种生物细胞里去筛选、鉴定出我们需要的基因，这可不是随便翻翻就能找到的，得用上各种高科技的手段和精密的仪器。
比如说，通过基因文库筛选、PCR 扩增技术等等，就像拿着超级放大镜和精细的镊子，一点点去挑出我们想要的宝贝基因。
然后，把这珍贵的基因放进一个合适的“运输工具”里，这工具就是载体。
载体就像是一辆超级小货车，能把基因安全又准确地运到目的地。
常用的载体有质粒、病毒载体等。
你想想，基因就像是乘客，载体就是那辆车，得保证车够结实，乘客才能顺利到达。
接下来，把带着基因的载体送进细胞这个“大工厂”，让细胞开始按照基因的指令生产药物。
这就像给工厂下达了一份超级精密的生产订单。
这一步可不容易，得保证细胞能“听话”，乖乖地按照基因的要求干活。
制造出来的药物还得经过一系列的加工和提纯，就像从一堆沙子里淘出金子一样。
要去除杂质、保证药物的纯度和活性。
这需要用到各种分离和纯化技术，比如色谱法、超滤法等等。
比如说胰岛素吧，这可是治疗糖尿病的重要药物。
制造胰岛素的时候，先找到控制胰岛素合成的基因，把它放进合适的载体，再送进细胞里让它生产胰岛素，最后经过提纯得到能治病救人的胰岛素药物。
再比如生长激素，也是通过类似的过程制造出来的。
找到相关基因，让细胞生产，然后精心提纯。
基因工程药物制造是不是很神奇？这就像是一场精细又复杂的魔法之旅，每一步都需要科研人员的智慧和努力，才能给我们带来这些救命又神奇的药物。
总之，基因工程药物制造是一项极其复杂又充满希望的技术，它给人类的健康带来了更多的可能和希望。
相信未来，还会有更多更厉害的基因工程药物出现，让我们的生活更加美好！。
举例说明基因工程药物的生产制备工艺流程
英文回答：The production process of gene-engineered drugs epasses several essential stages. Initially, the gene responsible for encoding the therapeutic protein is identified and isolated. Subsequently, this gene is inserted into a suitable vector, such as a plasmid, utilizing rbinant DNA technology. The vector harboring the gene is then introduced into a host organism, such as a bacterial or mammalian cell, through a process known as transfection or transformation. Once within the host cell, the gene is expressed, leading to the production of the therapeutic protein. This protein is subsequently harvested and subjected to a purification process to obtain the final drug product.基因工程药物的生产过程经过了几个基本阶段。
最初，负责编码治疗蛋白的基因被识别和隔离。
随后，这个基因被插入到一个合适的矢量中，如利用rbinantDNA技术的质子。
然后将隐藏该基因的矢量通过被称为转录或转化的过程引入宿主生物，如细菌或哺乳动物细胞。
一旦在宿主细胞内，基因得到表达，导致治疗蛋白的生产。
举例说明基因工程药物的生产制备工艺流程
举例说明基因工程药物的生产制备工艺流程Gene engineering drugs, also known as biopharmaceuticals, are a revolutionary class of medicines produced through the manipulation of genes and genetic material. The process involves several key steps from gene selection to drug formulation.The first step in the production process is gene identification and selection. Scientists identify and isolate the desired gene responsible for producing the therapeutic protein. This can be done by various methods, such as screening libraries of DNA or using recombinant DNA technology.我的问题是：举例说明基因工程药物的生产制备工艺流程基因工程药物，也被称为生物制药品，是通过操纵基因和遗传物质来生产的一类革命性药物。
该过程涉及从基因选择到药物配方的几个关键步骤。
生产过程的第一步是基因鉴定和选择。
科学家们确定并分离出负责产生治疗蛋白的理想基因。
这可以通过多种方法来完成，如筛选DNA库或应用重组DNA技术。
Once the desired gene is identified, it is inserted into a host cell for expression. This is typically done using cloning vectors, which are small pieces of DNA capable of carrying the desired gene into the host cell. The host cell could be a bacteria, yeast, or mammalian cell line depending on the complexity of the desired protein.After successful insertion into the host cell, gene expression takes place. The host cell then reads and interprets the inserted gene to produce the therapeutic protein. This step involves regulating gene expression through various transcription factors and regulatory elements.When enough therapeutic proteins have been produced by the host cell, the next step is protein purification. This process involves isolating the therapeutic protein from other cellular components and impurities. Differentpurification methods like chromatography, filtration, and centrifugation can be employed to achieve this.Once the pure therapeutic protein is obtained, it undergoes formulation and drug product development. The formulation process aims to stabilize the protein and optimize its pharmacokinetic properties. This typically involves formulating the protein into a suitable dosage form, suchas injectables or oral tablets.Quality control tests are conducted throughout the production process to ensure safety and efficacy of thefinal drug product. These tests include assays for identity, purity, potency, stability, and sterility.Overall, the production process of gene engineering drugs involves several stages – gene identification and selection, gene expression in host cells, protein purification, formulation development, and quality control. With advancements in biotechnology and genetic engineering techniques, the production of these innovative medicines continues to evolve for better healthcare outcomes.一旦确定了所需的基因，就将其插入宿主细胞进行表达。
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• （5）、相对分子量测定，还原型SDS-PAGE，
加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋 白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分 子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与 理论值比较，误差不得高于10%。 • （6）、残余外源性DNA含量测定，用放射性核 素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性 DNA应低于100pg。
一、基因工程菌的组建 • 目的基因的获得：将生产干扰素的白细胞的mRNA 分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵 母细胞，并测定合成干扰素的抗病毒活性，结果 发现12SmRNA的活性最高，因此用这部分mRNA合成 cDNA。将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗 性基因的质粒pBR322中，转化大肠杆菌K12，的几 千个重组子克隆，每个克隆都用粗提的干扰素的 mRNA去进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重 组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行翻 译，
二、基因工程干扰素的制备 • பைடு நூலகம்时每隔不同时间取2毫升发酵液，10000转每分 离心除去上清夜，称量菌体重量。 2、产物的提取和纯化
发酵完毕后，冷却，进行4000转每分离心，离心 30分，得湿菌体1000克左右。取100克湿菌体重 新悬浮于500毫升20毫摩尔每升磷酸缓冲液中 （pH7.0），于冰浴条件下进行超声波破碎，然 后4000转每分，离心30分，取沉淀部分，
•
三、质量控制标准和要求
• （2）、蛋白质含量测定，福林-酚法，以中国药 品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。 • （3）、比活性，效价的国际单位与蛋白质含量的 毫克数之比。 （4）、纯度，电泳纯度用非还原型SDS-PAGE 法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度 应在95%以上。
三、质量控制标准和要求
第十节 基因工程药物制造实例
• 干扰素（interferon IFN）是人体细胞分泌的一 种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免 疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其结构可分为α、β、γ、ω等4个类型。α 干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型， 其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是 用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵， 不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大 肠杆菌中发酵、表达来进行生产。
二、基因工程干扰素的制备
• 用100毫升含8摩尔每升尿素、20毫摩尔每升磷酸 缓冲液（pH7.0）、0.5毫摩尔每升二巯基苏糖醇 的溶液，室温搅拌抽提2小时，然后用15000转每 分离心，30分，取上清夜，用20毫摩尔每升磷酸 缓冲液（pH7.0）稀释至尿素浓度为0.5毫摩尔每 升，加二巯基苏糖醇至0.1毫摩尔每升，4℃搅拌， 15小时，15000转每分，离心30分除去不溶物。上 清夜经截流量为10000相对分子量的中空纤维超滤 器浓缩，将浓缩的人干扰素α2b溶液经过 Sephadex D50 分离，
一、基因工程菌的组建
• 对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活 性检测，经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA， 最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中， 转化大肠杆菌进行高效表达。
•
二、基因工程干扰素的制备 • 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装 • 1、发酵 人干扰素α2b基因工程菌为SW-IFNα-2b/E.coli DH5α, PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因，种子 培养基 含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯 化钠。 分别接种人干扰素α2b基因工程菌到4个装有250 毫升种子培养基的1000毫升摇瓶中，30℃培养10 小时，
三、质量控制标准和要求
• （4）、无菌试验，同半成品。 （5）、热源质试验，同半成品检定。 （6）、干扰素效价测定，同半成品检定，效价不 应低于标示量。 （7）、安全试验，取体重为350-400克豚鼠3只， 每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用 最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏 死、总体重不下降，说明成品合格。
三、质量控制标准和要求
• （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试 验和热源质试验。 • 2、成品检定 外观、活性、水分、无菌试验、安全毒性、热源 质。 （1）、物理性状，冻干品白色或微黄色疏松体， 加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。 （2）、鉴别试验，应用ELISA或中和试验检定。 （3）、水分测定，用卡氏法，应低于3%。
三、质量控制标准和要求
• 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按 人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天， 若动物全部存活，说明成品合格。
三、质量控制标准和要求
二、基因工程干扰素的制备
• 层析柱2厘米*100厘米，先用20毫摩尔每升磷酸缓 冲液（pH7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分 离，收集人干扰素α2b部分，经SDS-PAGE检查。 将Sephadex D50柱分离的人干扰素α2b组分，再 经DE-52柱（2厘米*50厘米）纯化人干扰素α2b组 分，上柱后用含0.05、0.1、0.15摩尔每升氯化钠 的20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）分别洗涤， 收集含人干扰素α2b的洗脱液。全过程蛋白回收 率为20-25%，产品不含杂蛋白，DNA及热源含量合 格。
三、质量控制标准和要求 • 1、半成品检定 效价测定、蛋白质含量测定、活性测定、比活性 测定、纯度测定、相对分子量测定、核酸含量测 定、鼠IgG含量测定、等电点测定、无菌试验、热 源质试验等。 （1）、效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基 本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校 准为国际单位。
三、质量控制标准和要求
• （7）、残余血清IgG含量测定，在应用抗体亲和 层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。 （8）、残余抗生素活性测定，半成品中不应有抗 生素活性存在。 （9）、紫外光谱扫描，检查半成品的光谱吸收值， 最大吸收值应在280纳米加减2纳米。 （10）、肽图测定， 用CNBr裂解法，测定结果 应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。 （11）、等电点测定，等电聚焦电泳。
二、基因工程干扰素的制备 • 作为发酵罐种子，用15升发酵罐进行发酵，发酵 培养基的装量为10升，发酵培养基由1%蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.01%氯化铵、0.05%氯化钠、 0.6%磷酸氢二钠、0.001%氯化钙、0.3%磷酸二 氢钾0.01%硫酸镁、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升 氨苄青霉素、少量防泡剂组成，pH6.8。转速500 转每分，通气量为1：1溶氧为50%。30℃发酵8 小时，然后在42℃诱导2-3小时完成发酵。