抗体与抗体动物种属来源
大分子药物的免疫原性评价
免疫原性评价PK/TK数据处理
方式： A：在计算平均值前剔除产生ADA个体的PK、TK数据 B:对影响PK行为的个体剔除数据 C:不管ADA产生，所以数据参与平均值计算 D:科学判断，Case By Case E：剔除和未剔除产生ADA的个体分别计算
基于风险评估的原则评判免疫原性，为临床免疫原性评价 和风险评估提供参考
很多拟用于人的生物制品对动物有免疫原性，因此该类产品进行长期毒性试验时,给药 期间应检测抗体以帮助解释试验结果。应明确抗体反应特点，如滴度、出现抗体的动 物数、中和或非中和抗体等，并将抗体的出现与所有药理和/或毒理的变化综合考虑。 尤其在解释数据时应考虑抗体形成对药代动力学/药效参数、影响范围和/或不良反应的 严重程度、补体活化或出现新毒性作用等的影响，也应注意评价与免疫复合物形成和 沉积有关的病理变化。《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》
免疫原性分析方法的挑战
一、多结构域药物：
多结构域药物类型： Fc、HSA融合蛋白 PEG化药物 双特异性抗体 ADC药物
多结构域药物结构上的复杂性使其免疫原性风险更为复杂，分析方法 建立更为复杂
注意点：通常需要在临床试验中区分与药物结合的表位，根据结合功 能区来区分ADA的风险
策略：基于风险、基于目的、基于数据
免疫原性分析方法的挑战
二、多聚体：
多聚体是天然结构或变性蛋白组成的高分子量聚合体 生产各环节、产品运输、保存、给药等过程均可能产生 多聚体产生会增高产品免疫原性风险，并导致严重的副作用
免疫原性分析方法的挑战
三、游离药物干扰ADA检测：
游离药物与游离ADA结合，影响ADA检出，导致假阴性
同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性
同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性陈曦;刘哲;邓茂林;冯轼【摘要】目的探讨同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性.方法本研究采用顺序法对小鼠结肠组织IL-17和肠神经胶质细胞源性神经营养因子GDNF 的特异性受体亚基GFR-α1进行同种属来源一抗的免疫荧光双标记染色.结果炎症状态下小鼠结肠组织黏膜及黏膜下层可见被绿色荧光和红色荧光双重标记的阳性细胞,提示IL-17+的Th17细胞表面有GDNF特异性受体亚基GFR-α1表达.结论采用顺序法进行免疫荧光双标记染色,尤其是当已知两种目标抗原表达位置不同时,向一种属来源的一抗仍可得出可信的实验结果.【期刊名称】《四川解剖学杂志》【年(卷),期】2015(023)001【总页数】4页(P13-15,19)【关键词】免疫荧光双标记染色;白介素-17/IL-17;GDNF家族受体-α1/GFR-α1【作者】陈曦;刘哲;邓茂林;冯轼【作者单位】成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041;成都大学附属医院消化内科,成都610041【正文语种】中文【中图分类】R329近年来，免疫荧光染色技术在生物及基础医学的科学研究中运用越来越广泛，当需要在同一组织／细胞上检查两种不同抗原时，则需要进行免疫荧光双标记染色［1］。
顺序法免疫荧光双标记染色因为操作流程复杂、操作时间长等缺点而濒于淘汰，但实际的科研工作中受实验经费、条件等限制，常常遇到一抗种属来源相同无法进行同步法免疫荧光双标记染色的情况。
本研究通过对小鼠结肠组织白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）［2］和肠神经胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotro-phic factor，GDNF）特异性受体亚基 GFR-α1（GDNF family receptor-α1，GFR-α1）［3］进行的种属来源一抗顺序法免疫荧光双标记染色，探讨了特异性分泌IL-17的肠Th17细胞中GDNF受体的表达，并对如何避免同种属来源一抗的交叉染色等问题进行了分析讨论。
抗体相关基本知识
抗体相关基本知识抗体相关基本知识抗体(antibody)是⽣物体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产⽣的、可与相应抗原发⽣特异性结合反应的免疫球蛋⽩(Ig)。
按抗体的来源，可将其分为天然抗体和⼈⼯制备的抗体，是通过对特定⽣物体免疫接种特定抗原物质后⽽获得。
⼈⼯免疫动物制备的抗体应⽤甚为⼴泛，既可以⽤于科学研究，也可以⽤于疾病的预防、诊断和治疗。
体⼀、抗体的基本结构的基本结构经x线晶体衍射结构分析发现，抗体Ig由四条多肽链组成，各肽链之间由数量不等的链间⼆硫键连接。
Ig可形成“Y”字型结构，称为I g 单体，是构成抗体的基本单位。
（⼀）重链和轻链天然Ig分⼦含有四条异源性多肽链，其中，分⼦量较⼤的两条链称为重链(heavy chain,H)，⽽分⼦量较⼩的两条链称为轻链(Light chain,L)。
同⼀Ig分⼦中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。
1.重链分⼦量为50000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。
重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。
据此，可将抗体Ig分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为µ链、δ链、γ链、α链和ε链，商品化的抗体绝⼤部分都是IgG。
不同类的Ig具有不同的特征，如链内和链间⼆硫键的数量和位置、结构域的数量及铰链区的长度等均不完全相同。
即使是同⼀类的Ig，其铰链区氨基酸组成和重链⼆硫键的数量、位置也不同，据此⼜可将同类Ig分为不同的亚类(subclass)。
IgG的亚类利⽤不同种属动物制备的IgG存在不同的亚类，常见的不同种属IgG亚类如下：兔:IgG（⽆亚类）⼩⿏:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgG3⼤⿏:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgM⼭⽺:IgG1,IgG2在进⾏某些抗体相关实验(如IF和FCM)的时候，我们常常需要仔细看⼀下所订购商品化抗体的IgG亚类，以⽅便我们选择同型对照(isotype control)IgG(即与⽬的蛋⽩抗体相同来源种属的相同类型正常IgG)作为抗体的阴性对照进⾏平⾏实验，以排除可能的⾮特异性染⾊结果。
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
抗体与抗体动物种属来源
（CD79A）IGBP-1 ( lmmunog lobuin binding protein-1)免疫球蛋白结合蛋白S-0298R -1◆兔抗人、大鼠、小鼠CD79A多克隆抗体◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆CD79a表达于从前B细胞到浆细胞的整个B细胞发育阶段。
CD79a与C D79b构成B细胞受体复合体，在介导lgM从细胞内转到细胞膜上起重要作用.CD79a是B细胞常用标记物。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人CD133 antigen造血干细胞抗原S-0209R ◆兔抗人、大鼠、小鼠CD133多克隆抗体◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆一般认为，VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）是HSCs（造血干细胞）的特异性标志。
近来经研究发现DD133分子是HSCs（造血干细胞）特异性标志。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人CEA（Carcino embryo nic Antigen）人癌胚抗原S-0060R ◆兔抗人人癌胚抗原多克隆抗体◆200ul/600.00 1ml/1800.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600◆癌胚抗原（Carcino embryo nic Antigen,CEA）是一种血浆糖蛋白，可用于早期辨认某些肿瘤，存在于胚胎中，刚出生后却不能被测出，以后当出现恶性肿瘤时能再次形成。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫双标,抗体如何选择？
免疫双标，抗体如何选择？注意几点：1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。
这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。
选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。
好的抗体真的还是很重要。
2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。
4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？可以做，过程还可省一步。
但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。
5）免疫双标荧光的图像如何整合？可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。
注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。
免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2. 抗体的选择一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。
3. 封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。
所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。
比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。
免疫双标一抗的选择主要有两种形式:第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。
第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。