浅谈病理制片中固定液的选择(一)
固定液总结
固定液总结什么是固定液？固定液是一种化学试剂，主要用于固定组织或细胞以保持其形态和结构。
固定液可以阻止生物材料的腐败和变性，防止其在处理和染色过程中失去结构和功能。
固定液在组织学、细胞学和病理学等领域中广泛应用，有助于观察和研究生物组织和细胞的形态、结构和功能。
常见的固定液福尔马林（Formalin）福尔马林是一种常见的固定液，广泛用于组织学研究和病理学诊断中。
它是一种含有37%甲醛的溶液，能够固定组织并保持其形态和结构。
福尔马林固定的组织可用于组织切片制备、免疫组化染色等进一步的实验。
福尔马林固定组织的优点是固定效果好、保存时间长，能够保存大部分的组织结构和抗原表达情况。
然而，福尔马林固定液会对细胞核和某些蛋白质产生交联作用，可能导致染色效果差，同时还有潜在的致癌风险，因此在使用福尔马林固定液时需要注意安全操作和废液处理。
乙醛（Glutaraldehyde）乙醛是一种常用的电子显微镜固定液，主要用于固定细胞和亚细胞结构以进行电子显微镜观察。
与福尔马林不同，乙醛固定液能够更好地保持细胞和细胞器的形态和结构，有利于观察细胞内部的细节。
乙醛固定液的使用需要注意浓度和固定时间的控制，过高的浓度和过长的固定时间可能会导致组织和细胞的变性和损伤。
此外，乙醛固定液对某些酶和蛋白质具有灭活作用，因此在使用乙醛固定液时需要根据实验需要选择合适的条件。
缓冲盐水（Buffered Saline）缓冲盐水是一种用于固定组织和细胞的温和固定液。
它通常由含有适当浓度的盐水和缓冲剂混合而成，能够保持组织和细胞的形态和结构，并且对某些抗原和酶具有较好的保存效果。
缓冲盐水固定液的优点是温和、安全、易于制备和使用，适用于一些对固定条件要求较宽松的实验。
然而，由于其固定效果不如福尔马林和乙醛固定液，保存时间较短，因此在实验设计时需要根据实验目的和需求来选择合适的固定液。
固定液的使用注意事项使用固定液需要注意以下几个方面：1.安全操作：固定液常常含有有害化学物质，使用时需要佩戴防护手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触和吸入液体或气体，注意实验室通风。
常用固定液的性质、用途
常用固定液的性质、用途和配置1．单一固定液的性质和用途（1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol）：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，后者易溶于水，所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。
酒精可溶解脂肪、类脂体，所以不能用酒精固定脂肪。
酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能在低于70％酒精中保存。
单独固定使用酒精的浓度应为95—100％。
无水酒精渗透力较差，并且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。
酒精除固定作用外，还具有硬化和脱水的作用，固定后的组织可保存于70％酒精中，所以酒精在制片过程中用途很大。
无水乙醇容易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其中水分，最好在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。
酒精是一种还原剂，不能与重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合使用。
（2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林，一般使用浓度为10％福尔马林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液10ml 与90ml 蒸馏水混合即可，实际上其含量只有4％甲醛。
这样的配法已成为一般实验室常用的惯例。
甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。
它是一种应用广泛，使用简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。
尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。
更适于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24 小时以上，固定后的组织可移入50％酒精中逐步脱水。
甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被氧化为甲酸。
在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24 小时后失效。
甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高温下又成为甲醛。
不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。
所以在备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。
固定液的选择原则
固定液的选择原则固定液的选择原则如下：1. 根据待分离组分的性质选择。
（1）分离非极性物质时，一般选用非极性固定液。
（2）分离极性物质时，一般选用极性固定液。
（3）分离极性和非极性物质时，一般选用极性或氢键型固定液。
（4）分离能形成氢键的物质时，一般选用氢键型固定液。
（5）分离具有不同程度极性或氢键的物质时，一般选用能形成氢键型的混合固定液。
2. 根据流动相的性质选择。
（1）当流动相极性小于固定相极性时，对非极性物质具有良好的分离效果。
（2）当流动相极性大于固定相极性时，对极性物质具有良好的分离效果。
（3）当流动相中含有亲水性的离子或粒子时，对极性物质具有良好的分离效果。
（4）当流动相中含有亲油性的分子或粒子时，对非极性物质具有良好的分离效果。
3. 根据分离模式选择。
（1）正相色谱：一般选用极性或氢键型固定液，对于极性较大的组分，可选用非极性固定液。
（2）反相色谱：一般选用非极性或中等极性的固定液，对于某些极性较大的组分，也可选用极性或氢键型固定液。
（3）离子色谱：一般选用离子交换型的固定液，根据所带电荷的性质选择合适的固定液。
（4）分子排阻色谱：一般选用凝胶型的固定液，根据分子尺寸的大小选择合适的固定液。
（5）疏水作用色谱：一般选用疏水型的固定液，根据疏水作用的强弱选择合适的固定液。
4. 根据实验条件和要求选择。
（1）对于需要高分辨率的分离，一般选用选择性较高的固定液。
（2）对于需要在较短时间内完成分离的，一般选用速度较快的固定液。
（3）对于需要在较高温度下进行分离的，一般选用高温稳定的固定液。
（4）对于需要痕量分析的分离，一般选用灵敏度较高的固定液。
5. 注意保护环境：选择环保型的固定液，避免使用对环境不友好的有机溶剂作为固定液。
总之，在选择固定液时，需要根据待分离组分的性质、流动相的性质、分离模式、实验条件和要求以及环保因素综合考虑，以得到最优的分离效果。
一些固定剂的配方及性能介绍
一些固定剂的配方及性能介绍固定，就是用某种方法以最快的速度将细胞杀死并保持组织及细胞原有的形态结构及其组成。
固定在组织制片中极为重要，因为机体死后血液循环停止，细胞逐渐死亡，如不立即处理，则细胞内的酶（水解酶）会使蛋白质分解为氨基酸渗出细胞，使细胞溶解破坏，组织变形，在无冰藏的条件下，更可因其病原微生物的迅速繁殖而腐败，组织结构破坏，不利于形态学的诊断。
组织固定的目的为1、迅速防止组织、细胞死后变化，防止自溶与腐败，以保持和细胞与正常生活时的形态相似；2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶解物质，以保持它原有的结构与生活时相仿；3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折光率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察；4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片；5、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有的形态结构；经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。
为了能够达到固定的目的，固定剂必须具备以下的性质和条件：1、迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有较大变化；2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定；3、使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变；4、在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理，而使固定后的原生质变形；5、尽可能避免使组织膨胀或收缩（不致改变原生质原来的体积）；6、能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来；7、增加细胞内含物的折光度，易于鉴别，增加媒染作用和染色作用；8、使细胞变硬，适于切片，但又不使材料太坚硬或松脆；9、使组织充分固定，便于保存。
[1][2]下面我们介绍中华医学会病理分会推荐的几种常用固定剂的性能[3]：1、4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液配方：甲醛（40%）100ml，无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠4.0g，蒸馏水900ml。
固定液的要求
固定液在气相色谱、液相色谱以及组织学等领域中有着重要的作用，其主要要求如下：
1. 挥发性低：在操作温度下，固定液的蒸气压应尽可能低，以减少在分析过程中固定液的流失，确保色谱柱的稳定性和使用寿命。
2. 热稳定性好：在工作温度范围内，固定液必须具有良好的化学和热稳定性，避免因受热分解而影响分析结果或损坏色谱柱。
3. 适宜的粘度：固定液的粘度不宜过高，较低的粘度可以加快样品组分在两相之间的传质速度，提高色谱柱的分离效率。
高粘度会降低分子扩散速率，从而降低柱效。
4. 选择性匹配：对于不同的样品类型和分析目标，应选择具有合适选择性的固定液。
固定液的选择性决定了它对不同极性、沸点相近的物质的保留能力差异，以便有效分离复杂混合物中的各组分。
5. 溶解性能：固定液需要有足够的溶解能力来溶解待测样品的部分或全部组分，同时又不能与样品发生不可逆反应。
6. 无毒或低毒：尤其在生物样品分析时，所选用的固定液应尽量无毒或低毒，不会对人体健康和环境造成危害。
7. 兼容性：固定液需与色谱柱填料（载体）、载气及样品兼容，不产生不良反应。
总结来说，选择合适的固定液是保证色谱分析准确、高效的关键步骤之一，需要综合考虑多种因素，确保满足实验需求。
组织固定固定液的选择
组织固定固定液的选择影响标本固定的因素很多，如组织与固定液的比例、固定时间、固定温度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所选固定液不当，细胞内蛋白质、脂类、核酸等成分将会有不同程度地损失。
固定剂最好随配随用，并注意其浓度和酸碱度。
因此根据实际工作的目的，选用合适的固定液非常重要。
下面是一些常用固定液的配制方法及适用范围。
1．单纯固定液(1)4％中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。
一般无特殊要求的病理标本均适用。
尤其值得注意的是，中性甲醛是以 pH7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
甲醛(40%) 100 ml无水磷酸氢二钠 6.5 g磷酸二氢钠 4.0g蒸馏水 900 ml(2)乙醇固定液：使用时以80％～95％的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用100%乙醇固定组织。
(3)4％的多聚甲醛：主要用于培养细胞的固定。
2．混合固定液(1)乙醇一甲醛(乙醇－福尔马林，AF)固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。
甲醛(40％) 100 ml95％乙醇 900 ml(2)B5(醋酸钠一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
无水醋酸钠 1.25 g升汞 6.0 g蒸馏水 90 ml使用前加入甲醛 10 ml(3)Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
饱和苦味酸水溶液(约1.22%) 75 ml甲醛 25 ml冰醋酸 5 ml(4)Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦适用于糖原及尼氏小体的固定。
固定液的选择
之前交的作业固定液的选择总原则：“相似相溶”(1) 分离非极性组分时通常选用非极性固定相。
各组分按沸点顺序出峰,低沸点组分先出峰。
(2) 分离极性组分时一般选用极性固定液。
各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。
(3) 分离非极性和极性的混合物一般选用极性固定液。
此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。
担体的作用气相色谱达到完全分离时的分离度，达到98%分离时的分离度影响高效液相色谱峰扩展的因素及可忽略因素气相色谱检测器根据响应原理的不同可分为浓度型检测器和质量型检测器两类。
浓度型检测器：如热导池检测器（TCD）质量型检测器，如氢火焰离子化检测器（FID）HPLC与GC差别：分析对象的区别；流动相的区别；操作条件差别提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。
液固吸附色谱法：影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，t R↑溶剂分子极性↑，洗脱能力↑，k↓，t R↓出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异；正相色谱——固定液极性 >流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱✓适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱✓适于分离非极性组分化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检侧系统、记录及数据处理系统影响原子吸收光谱谱线变宽的几个因素原子吸收光谱光源作用空心阴极灯优缺点原子化系统作用富燃火焰（燃助比大于计量比）还原性火焰；贫燃火焰（燃助比小于计量比）氧化性气氛原子化过程分为干燥、灰化（去除基体）、原子化、净化（去除残渣）四个阶段，待测元素在高温下生成基态原子。
原子吸收光谱法分析中的干扰主要包括物理干扰、化学干扰、电离干扰和光谱干扰（1）消电离剂—-为了克服电离干扰一方面可以控制火焰温度，另一方面可以加入大量的易电离元素以抑制待测元素的电离。
固定液的分类和选择原则
固定液的分类和选择原则以固定液的分类和选择原则为标题，我们来探讨一下固定液的相关知识。
一、固定液的分类固定液是一种用于固定生物组织或细胞的溶液，根据不同的固定目的和化学成分，可以将固定液分为以下几类：1. 醇类固定液：如乙醇、甲醇等。
这类固定液常用于快速固定和保存细胞和组织的形态结构，同时具有很好的保护作用，适用于常规组织学检查。
2. 酸类固定液：如酸性酒精、酸性硫酸铜等。
这类固定液主要用于固定某些特定的细胞或组织结构，例如染色体或胶原纤维等。
酸类固定液对脂质物质的固定效果较差，因此不适用于脂质含量较高的样本。
3. 中性缓冲液：如PBS（磷酸盐缓冲液）、Hank's液等。
这类固定液主要用于固定细胞和组织的生物学活性，能够较好地保持细胞和组织的形态和功能，适用于免疫组化和分子生物学实验。
4. 有机溶剂固定液：如乙酸、乙酸乙酯等。
这类固定液在固定过程中对细胞和组织的脂质物质和溶胀性物质具有较好的固定效果，适用于脂质或溶胀性物质含量较高的样本。
二、固定液的选择原则在选择固定液时，我们需要考虑以下几个原则：1. 根据固定目的选择：不同的实验目的需要选择不同的固定液。
例如，要观察细胞形态结构，可以选择醇类固定液；要进行免疫组化实验，可以选择中性缓冲液。
2. 根据样本性质选择：不同的样本性质对固定液的选择有所差异。
例如，脂质含量较高的样本适合选择有机溶剂固定液；而含有胶原纤维的样本可以选择酸类固定液。
3. 考虑固定液的渗透性：固定液的渗透性对于固定效果至关重要。
一般来说，较强的渗透性可以提高固定效果，但同时也可能对细胞或组织的形态和功能产生一定影响。
因此，需要根据具体实验要求选择合适的固定液。
4. 考虑固定液的毒性和安全性：固定液中可能含有一些有毒物质，因此在选择固定液时，需要考虑其对实验人员和环境的安全性。
同时，在实验过程中也要注意安全操作，避免接触到固定液。
总结：固定液的分类和选择原则是进行组织学和细胞学研究中非常重要的一环。
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浅谈病理制片中固定液的选择(一)
论文关键词]病理；固定液；甲醛；乙醇论文摘要]在病理组织诊断中制片过程尤为重要，而在病理制片的过程中组织的固定更为关键，故而对于石蜡切片，组织的固定则是必不可少的重要步骤。
在多年的临床经验中，笔者对AF、AAF及甲醛一生理盐水三种混合固定液的优劣进行仔细分析、对比，从而认为混合固定液与其他固定剂固定效果相比之下较为优越。
由于病理学诊断是诊断的金标准，是辅助临床诊断的主要把关口，也是最后的宣判性诊断。
做好病理诊断，层层步骤就显得尤为重要，包括组织的取材，固定，脱水，浸蜡，包埋及染色。
组织的固定是一个关键的过程，因为没有好的固定就没有好的制片，没有好的制片就不会有好的成品，一张好的切片与固定有着密切的关系。
1固定的目的
固定的概念是将采取的活体组织置于化学性溶媒(固定液)中，使其不发生自溶与腐败，保持被采取时的形态。
固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态，迅速防止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
因此，固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时，应使用足量的固定液。
其固定液的量一般小于组织块总体积的4倍以上。
2固定液的选择
固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。
组织细胞中不至于因固定引起人为的改变，因为在凝固原生质以后，增加了细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形，并尽可能地避免使组织膨胀或收缩，使细胞内的成分(蛋白质)凝固沉淀下来，由正常的半液体状(胶体)变为半固体状(凝胶)，增加媒染作用和染色能力，使组织能够得到充分的固定，便于以后的蜡块保存。
固定液的种类很多，分为单纯固定液和混合固定液，其中混合固定液比较常用。
2.1常用单纯固定液
2.1.1甲醛(formaldehyde)为非沉淀性固定剂，是一种约有40％重量溶于水的气体，易挥发，市售的为40％的甲醛水溶液，也称为福尔马林液(formalin)。
此液久存自行分解，形成白色沉淀为副醛(三聚甲醛或多聚甲醛)。
用于组织固定的浓度为10％，实际浓度含甲醛为4％。
其固定液渗透能力很强，固定均匀，对组织收缩小，故而对于免疫组织化学标本的制作常用此液。
2.1.2乙醇(alcoh01)即乙醇，为还原剂，无色液体，可与水无限相溶，固定兼脱水，用于固定的浓度为80％－95％。
用于糖原、纤维蛋白及弹性纤维的固定，乙醇的渗透力较甲醛弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。
缺点为渗透能力相对较弱，且易挥发和吸收空气中的水分，故而使用时应盖好容器；并对色素有破坏。
2.1.3醋酸(aceticacid)又名乙酸，为带有刺激气味的无色液体，低于15℃为冰醋酸，可溶于水，能沉淀核蛋白，可较好地保持染色体结构，把未分裂细胞核的染色质沉淀为块状体，从而更清楚地显示细胞核结构。
5％的醋酸pH2－8，可抑制细菌和酶的活性，可防止自溶，缺点为组织膨胀较明显，对于胶原纤维与纤维蛋白尤其明显。
一般很少单独使用。
2.2常用混合固定液
2.2.1AF液(乙醇+甲醛液)配方：95％乙醇或无水乙醇90ml+40％甲醛10ml。
此液不但有甲醛的固定作用，并兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖原，效果较好，米粒大小的胃镜等标本需要4－6h，其余外检的大块组织需用12－24h，其优点是固定后可不经水洗，直接放人
95％E,醇继续脱水，大大减少了脱水的过程和缩短了脱水时间，增加了工作效率。