小鼠肝细胞原代培养、灌注
小鼠肝细胞的分离与原代培养
Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｉ ｒ ｅ ｌｃ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｕｌｕ ｅ；ｈ ｐａ ｏ ｙ ｅ ｅ ｔ ｃ ｔ ｓ；ｃ ｌ ｉｏｌ ｔｏ ｅ １ ｓ ａ ｉ ｎ；ｃ ｌ ｃ ｌｕｒ ｅ１ ｕｔ ｅ
肝 脏 作 为 机体 重要 的代 谢 器 官 ， 多 种 生 理 病 理 过 程 中 在 发 挥 重 要 作 用 ， 细 胞 行 使 了肝 脏 主 要 的功 能 ， 合 成 凝 血 肝 如 因子 和 血 清 白蛋 白 及 多 种 消 化 酶 、 与 内 分 泌 调 节 、 谢 多 参 代
态 变 化 进行 观察 ， 进 一 步 进 行 相 关研 究奠 定 基 础 。 为
赖 静 杨天 燕 韦锦斌 。 王乃平
南 宁 ５０ ０ ） ３ ０ １
（ 西 中医 学 院 药 学 院 广
摘 要 目的 ： 求 一 种 简 易 、 济 的小 鼠原 代 肝 细 胞 的 分 离 与 培 养 方 法 。方 法 ： 用 非 灌 注 法 分 离 小 鼠 肝 脏 ， 用 ０ ２ Ｉ 探 经 采 利 ． Ｖ型胶 原 酶 对 肝脏 消 化来 获 取肝 细胞 ， Ｄ 以 ＭＥ 培 养 基 对 肝 细 胞 进 行 单 层 培 养 。 结 果 ： 较 成 功 地 进 行 了 原 代 肝 细 胞 培 养 ， 进 行 Ｍ 比 并
４ ８ｇ Ｉ ． ／ ＨＥＰ ＥＳ， 胎 牛 血 清 （ 季 青 ） ５ ｍＬ Ｌ Ｌ 谷 氨 酰 ５ 四 ， ／
种 营 养 物 质 、 存 葡 萄 糖 、 除 毒 素 等 ， 代 培 养 的 肝 细 胞 广 储 清 原 泛 用 于 药 理 学 、 理 学 、 疫 学 、 子 生 物 学 、 胞 生 物 学 等 毒 免 分 细 相 关 的 研 究 ， 其 在 药 物 研 发 方 面 ， 用 原 代 肝 细 胞 可 较 经 尤 使 济 和 迅 速 地 阐 明 药 物对 药物 代 谢 酶 的 诱 导 或 抑 制 作 用 ， 而 从 避 免 采 用 大 量 动 物 进行 药理 效 应 筛 选 。但 是 ， 于 原 代 肝 细 由 胞 增 殖 能 力 差 ， 易 长 时 间 保 存 或 长 期 培 养 及 其 生 物 学性 状 不
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
原代小鼠肝细胞培养方法的比较
原代小鼠肝细胞培养方法的比较王珊;柏青;王方萍;李慧瑶;陈燊;何志妮;王庆;陈雯;陈丽萍【摘要】目的:比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方.方法:采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞.镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平.结果:成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95％以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87％和67.16％(P＜0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P＜0.05).此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185％和24.2％(P＜0.05).结论:小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2016(028)002【总页数】6页(P125-130)【关键词】小鼠;原代肝细胞培养;二甲基亚砜;表皮生长因子【作者】王珊;柏青;王方萍;李慧瑶;陈燊;何志妮;王庆;陈雯;陈丽萍【作者单位】中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080【正文语种】中文【中图分类】R114【ABSTRACT】OBJECTIVE: To identify a better maintenance medium for primary hepatocyte culture in vitro，wecompare the cellular morphology and function of mouse primary hepatocytes under three different culture conditions.METHODS：Primary hepatocytes were isolated by using a modified two-step collagenase perfusion procedure asdescribed by Seglen. The purity of hepatocytes were determined by PAS staining. After plating for 4 h，the medium wasreplaced with three different maintenance medium (base medium，base medium supplemented with DMSO，base mediumsupplemented with DMSO and EGF). The cellular morphology was observed under an inverted microscope. The cellviability was measured using the MTT assay，the concentrations of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by automaticbiochemical analyzer and the albumin level was examined using ELISA. RESULTS：Mouse primary hepatocytes weresuccessfully isolated with purity more than 95%. When primaryhepatocytes were cultured for 96 h ，only the DMSO grouphad better cell morphology. Viability of cells in the base medium group was reduced by 66.87% and 67.16% compared withthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05)，respectively. The LDH level of the base medium group was higher thanthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05). In addition，cells in the DMSO group had high level of albumin secretionat 96h which was 185% and 24.2% higher than the base medium and the DMSO+EGF group (P＜0.05)，respectively.CONCLUSION：DMSO addition to maintenance medium supported primary hepatocytes to maintain its morphology andfunction. Our study provides an applicable method for optimization of primary hepatocytes in culture.【KEY WORDS】mouse；primary hepatocyte culture；dimethyl sulfoxide；epidermal g rowth f actor原代肝细胞作为一种肝毒性评价体外模型，既能较好地保留肝脏的代谢功能，还可反映外源化学物的刺激，并能排除其他细胞、组织的影响，具有良好的可重复性，被认为是目前体外毒理学和药物试验的重要研究模型而得到广泛应用[1]。
原代肝细胞培养
原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
细胞生物学实验-小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。
因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。
一般采用2-5代的细胞进行实验。
当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。
但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
小鼠肝细胞原代培养
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精 中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打 开腹腔,取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取 一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无 血清培养液淋洗2～3次。
5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化 液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离 心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10%胎牛 血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培养。
本内容仅供参考,如需使用，请根据自己实际情况更改后使用！
放映结束 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ谢各位批评指导！
谢 谢！
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原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
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小鼠肝细胞原代培养+灌注
我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。
目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。
具体操作步骤如下：
1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。
分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。
追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，
结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素100U。
缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。
在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠
远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。
迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。
之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。
2:灌注液的配置：
Perfusion Solution 1（g/L）：
NaCL 8.000
NaH2PO4•2H2O 0.078
KCL 0.400
Na2HPO4•12H2O 0.151
NaHCO3 0.350
EDTA 0.190
HEPES 2.380
Glucose 0.900
磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计），0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。
Perfusion Solution 2（g/L）：
NaCL 8.000
KCL 0.400
CaCL2 0.560
NaH2PO4•2H2O 0.078
Na2HPO4•12H2O 0.151
HEPES 2.380
NaHCO3 0.350
Collagenase Ⅳ0.500
搅拌器使固体成分充分溶解，4℃冰箱过夜，以后同上。
4:灌注步骤：
4.1 37℃Perfusion Solution 1沿门静脉插管灌注肝脏，流速20－30ml /min，灌洗10min左右，至肝脏呈现灰白色为止
4.2 Hanks液80ml 短时间灌注，约2min，冲出EDTA
4.3 37℃Perfusion Solution 2 沿门静脉插管灌注肝脏，流速20mL/min，灌洗10min左右，循环使用
4.4 肝脏变软，塌陷后用无菌镊钝性分离肝细胞，去除肝包膜及血管等结缔组织，将含有胶原酶的肝细胞悬液放入250ml无菌烧杯中（杯口用无菌锡纸包裹），37℃水浴5min
4.5加入无指示剂的DMEM基培，双层无菌纱布过滤
4.6将滤液放入50ml离心管中，应用无指示剂的DMEM基培，4℃、50g、3min洗涤肝细胞3次
5:获得的细胞经过以下的纯化，应用特定的培养基培养。
提供几篇文章
1. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Chacko, J., and Trump, B. F. (1981). Mouse liver cell culture 1. hepatocyte isolation. IN VITRO Vol.17.No.10 October, 913-925.
2. Kreamer, B. L., Staecker, J. L., Sawada, N., Sattler, G. L., Hsia, M. T. S., and Pitot, H. C. (1986) Use of low-speed ,iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIO. Volume 22,Number 4,April 201-211.
3. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., (1989) Lysis of cultured mammalian cells. Molecular Cloning. 18.34。