外泌体蛋白质组学研究进展_图文(精)
外泌体研究ppt课件
胞膜融合, 由细胞主动分泌释放到细胞外的腔
泌
内囊泡 (intraluminal vesicles, ILVs)。
体
直径约为30-150nm，具有“杯状”或 “碟状”形态, 外侧含有脂质双分子层。
的 携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。
“货物”释放进入胞质内，并重新形成多
泌
不同来
泡体。
源的外
体
泌体进
外泌体直接与受体细胞膜融合，将携
入受体
带的“货物”释放进入受体细胞胞质。
的
细胞的 方式
外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊
特
受体结合，既能起到信号传导作用，也能 通过内吞作用，将“货物”运入胞内。
征
.
8
外
泌
鉴 定
体 的 分
分
特 点
离 方 法
大部分内容物在外泌体的保 护下能够存在较长时间不被降解 并保持活性，具有较长的半衰期，
药肿
物 载
的
瘤 治
体疗
并且能作用于体内大部分器官，甚至于中枢 神经系统。普通药物会因为血脑屏障的存在 而被拒之脑外，无法发挥其药物活性，而外 泌体作为一种脂质囊泡则能够通行自由，对 于靶向脑部的药物有非常大的发展空间。
试剂盒
近年来各种商业化的外泌体提取试剂 盒逐渐得以推广。
.
9
研究生科研汇报
外 泌 鉴 体的 透射电子显微镜 定 (transmission electron microscopy, TEM) 分 观察外泌体的大小、 形态，测量直径 离 与
外泌体在肺部疾病中的研究进展
网络出版时间：２０２３－１０－３０１９：３８：４０ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１０２７．１５２９．００４外泌体在肺部疾病中的研究进展黄 宁１，２，胡长平１，３（１．中南大学湘雅药学院药理学系，湖南长沙 ４１００７８；２．郑州大学第一附属医院药学部，河南郑州 ４５００５２；３．心血管研究湖南省重点实验室，湖南长沙 ４１００７８）收稿日期：２０２３－０３－２９，修回日期：２０２３－０６－１７基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２１７３８１７）作者简介：黄 宁（１９９２－），女，博士生，研究方向：心血管药理，Ｅｍａｉｌ：ｎｈｕａｎｇ２０２１＠１６３．ｃｏｍ；胡长平（１９６９－），男，博士，教授，研究方向：心血管药理，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｈｕｃｈａｎｇｐｉｎｇ＠ｃｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０４１３６文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１１－２００６－０６中国图书分类号：Ｒ ０５；Ｒ３２９．２４；Ｒ５４４；Ｒ５６３；Ｒ５６２ ２５；Ｒ７３４ ２摘要：多种细胞可分泌外泌体，外泌体含有丰富的内容物（包括蛋白质、脂质及核酸）。
生理和病理条件下，外泌体及其内容物可介导细胞间物质传递与信号转导，参与细胞增殖与凋亡、迁移与分化、肿瘤侵袭与转移、炎症反应等过程。
研究表明，外泌体可参与多种肺部疾病的病理进程，外泌体及其内容物可以作为肺部疾病诊断、治疗及预后的新靶点。
因此，外泌体在肺部疾病中具有广泛的临床应用潜能。
关键词：外泌体；肺动脉高压；慢性阻塞性肺疾病；哮喘；肺癌开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）： 外泌体（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）是细胞膜向内凹陷形成包含管腔小体的多囊泡体，并通过与细胞膜融合释放到细胞外，形成异质性细胞外囊泡（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＥＶｓ），异质性体现在其细胞起源、大小、内容物和对靶细胞的作用。
外泌体的生物学特性及临床应用的研究进展
3、工程领域的研究进展 （1）生物材料：外泌体具有理想的生物相容性和 生物活性，可以作为生物材料用于组织工程和再生医学。例如，外泌体可以作为 细胞培养的支架材料，提供细胞生长和分化的微环境；还可以作为药物载体，提 高药物的靶向性和疗效。
（2）纳米技术：外泌体具有类似于细胞膜的结构和组成，这使得它们在纳 米医学领域具有广泛的应用前景。通过将外泌体进行分离、纯化和改性，可以制 备出具有特定功能和性质的纳米颗粒，用于药物输送、成像技术和生物传感等方 面。
参考内容
外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，它们携带着多种生物活性分子，如蛋白 质、核酸和磷脂等，参与细胞间通讯、组织修复和神经系统等多种生物学过程。 近年来，外泌体研究取得了重大进展，本次演示将对外泌体的生物学功能和应用 进行详细阐述。
一、外泌体的背景
外泌体最初被发现于1983年，是由Weber和Wiechmann在红细胞中发现的。 它们是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的囊泡，由单层膜构成，内含多种生物 活性分子。外泌体的分泌过程需要细胞内多分子复合物的参与，包括 ESCRT-0、 ESCRT-I、ESCRT-II和ALIX等蛋白。
结论
外泌体在医学和基础科学领域的研究取得了显著进展，其在疾病诊断、药物 输送、细胞通信和免疫调节等方面的作用逐渐被揭示。未来，随着对外泌体的深 入研究和技术创新，有望为疾病的诊疗、组织工程和再生医学等领域提供更多新 的应用和治疗方
法。因此，我们呼吁进一步深入探索外泌体的功能和应用，为人类健康事业 做出更大贡献。
然而，外泌体研究仍面临一些挑战，如外泌体的纯度问题、分泌机制的不明 确以及其在疾病诊断和治疗中的可靠性等。为了解决这些挑战，需要进一步深入 研究外泌体的分泌机制和生物学功能，并探索其在临床上的应用潜力。
外泌体的研究进展
外泌体的研究进展一、本文概述随着生物医学研究的深入，细胞间的信息交流机制逐渐成为研究的热点。
作为细胞间交流的重要载体，外泌体（Exosomes）的研究在近年来取得了显著的进展。
本文旨在综述外泌体的基本特征、生物学功能及其在疾病诊断和治疗中的应用，同时探讨当前面临的挑战和未来的发展趋势。
我们将简要介绍外泌体的定义、结构特点以及产生机制，帮助读者理解其作为细胞间信息传递的重要角色。
接着，我们将重点讨论外泌体在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等医学领域的研究进展，包括外泌体在疾病发生发展中的作用机制，以及作为疾病标志物的潜力。
我们还将关注外泌体在疾病诊断和治疗中的应用前景，如作为药物递送载体、肿瘤疫苗以及生物标志物等方面的研究。
我们将对当前外泌体研究面临的挑战和未来的发展方向进行深入探讨，以期为推动外泌体在生物医学领域的应用提供有益的参考。
二、外泌体的结构与功能外泌体是一种由细胞主动分泌的，直径约为30-150纳米的膜性囊泡，普遍存在于各种体液中，包括血液、尿液、乳汁、脑脊液和细胞培养基等。
这些囊泡在细胞间的物质传递、信息交流以及免疫反应等方面发挥着重要作用。
近年来，随着外泌体研究的深入，其独特的结构和功能逐渐被人们所揭示。
结构上，外泌体由磷脂双分子层膜包裹着内部的水溶液组成，其膜上嵌有多种蛋白质，包括四跨膜蛋白、热休克蛋白、整合素等。
这些蛋白质不仅参与外泌体的形成和分泌过程，还负责将外泌体与靶细胞进行特异性结合，实现精准的物质传递。
外泌体的膜上还含有丰富的糖类和脂质，这些成分对于外泌体的稳定性和功能也至关重要。
功能上，外泌体具有多种生物学活性。
外泌体可以传递信息分子，如mRNA、miRNA、蛋白质等，这些分子在细胞间的信息交流过程中发挥着关键作用。
外泌体可以参与免疫反应，通过传递抗原或免疫调节分子，影响免疫细胞的活性和功能。
外泌体还具有促进血管生成、抑制肿瘤生长等多种生物学活性。
值得一提的是，外泌体的功能与其来源细胞密切相关。
蛋白质组学PPT课件
代谢性疾病蛋白质组学研究通过对糖尿病、肥胖症等代谢 性疾病相关蛋白质的分析，发现了一些与代谢过程密切相 关的关键蛋白质。这些蛋白质涉及糖代谢、脂肪代谢等多 个方面，为药物研发和个体化治疗提供了新的思路和靶点 。同时，对代谢性疾病蛋白质组学的研究也有助于深入了 解疾病的发病机制，为疾病的预防和治疗提供科学依据。
蛋白质组学揭示基因表达 的复杂性
蛋白质组学研究关注基因表达的最终产物蛋白质，揭示了基因表达的复杂性和多样性 。蛋白质的表达和功能受到多种因素的影响 ，如翻译后修饰、蛋白质相互作用等，这些
因素在基因组学研究中难以全面考虑。
蛋白质组学与代谢组学的关系
代谢组学为蛋白质组学提供上下文
代谢组学研究生物体内小分子代谢物的变化，为蛋白质组学提供了上下文和背景。蛋白 质的功能和表达往往与代谢物的变化相互关联，了解代谢物的变化有助于更深入地理解 Nhomakorabea02
蛋白质组学研究技术
蛋白质分离技术
双向凝胶电泳技术
通过改变电泳的pH值和电场强度， 将复杂的蛋白质混合物分离成多 个有序的蛋白质带，以便后续的 鉴定和分析。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在固相支持物上， 通过与特定的配体或抗体相互作 用，实现对蛋白质的快速、高通 量筛选和检测。
蛋白质免疫沉淀技
术
利用抗体与目标蛋白质的特异性 结合，将目标蛋白质从复杂的混 合物中分离出来，常用于蛋白质 相互作用的研究。
详细描述
癌症蛋白质组学研究通过对癌症细胞和正常细胞蛋白 质表达谱的比较，发现了一系列与癌症发生发展相关 的关键蛋白质。这些蛋白质涉及细胞信号转导、细胞 周期调控、细胞凋亡等多个方面，为癌症治疗提供了 潜在的药物靶点。
案例二：神经退行性疾病蛋白质组学研究
人HEK293T细胞外泌体的蛋白质组学分析
人HEK293T细胞外泌体的蛋白质组学分析殷爱红;胡家;任晓曦;杨颖【摘要】目的建立一套完整的外泌体样品提取,液质联用蛋白质组学检测方法.方法采用超速离心法提取细胞培养液外泌体,经过 FASP酶切,收集酶解肽段,通过Easy-Nano LC液相色谱仪和Triple TOF6600质谱仪(美国Sciex公司)液质联用检测外泌体全酶解产物,并通过ProteinPilot软件(Sciex)处理数据,检索Uniprot的相应数据库,从而鉴定外泌体蛋白质.结果通过超速离心法,成功提取到细胞培养液外泌体.并通过LC-MS-MS方法,软件分析和数据库检索到833个匹配蛋白.结论此方法可有效获取外泌体,并鉴定外泌体蛋白质.【期刊名称】《继续医学教育》【年(卷),期】2018(032)010【总页数】3页(P138-140)【关键词】外泌体;超速离心;FASP酶解;LC/MS/MS【作者】殷爱红;胡家;任晓曦;杨颖【作者单位】首都医科大学中心实验室,北京 100069;首都医科大学中心实验室,北京 100069;首都医科大学基础医学院,北京 100069;首都医科大学中心实验室,北京100069【正文语种】中文【中图分类】R341外泌体（exosomes）是活细胞分泌的来源于晚期核内体（也称为多囊泡体）的膜性小囊泡。
其天然存在于真核生物的体液中，包括血液、尿液、唾液、母乳、脑脊液以及细胞培养液。
多数报道中的外泌体是直径在30～100 nm[1]，密度在1.13～1.21 g/ml的小囊泡。
近几年，人们发现外泌体中含有细胞特异的蛋白质、脂质和核酸，它可作为信号分子传递给其他细胞，进而改变其他细胞的功能[2]。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长和迁移、组织损伤的修复中起着重要作用。
不同来源细胞分泌的外泌体有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
近些年外泌体的应用越来越受到关注，有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
外泌体蛋白质组学
百泰派克生物科技
外泌体蛋白质组学
外泌体蛋白质组学旨在研究外泌体的蛋白质组成，基于质谱的方法可以用于外泌体蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的外泌体蛋白质组分析服务。
外泌体蛋白质组学
外泌体是一种由脂质双分子层膜包裹着蛋白质和RNA等细胞分泌物的细胞外囊泡，可分泌自大多数细胞，存在于大多数体液（如血液、尿液、唾液等）和细胞培养液中。
外泌体中的蛋白质含量较多，且这些蛋白质涉及的功能范围较广。
外泌体蛋白质组学旨在利用蛋白质组学技术从整体水平上研究外泌体中的蛋白质，从而助力外泌体的功能研究和临床应用，例如筛选与鉴定生物标志物、发现药物靶点等。
外泌体蛋白质组学1。
外泌体蛋白质组分析
外泌体进行蛋白组学研究的首要步骤是分离和提取外泌体。
目前外泌体提取的常用方法包括有超速离心法、凝胶过滤法、磁珠法以及聚合物沉淀法等，它们均有不同的优缺点，研究人员可根据实际情况选择合适的方法。
在外泌体提取完成后，可通过凝胶电泳、色谱技术、质谱技术等方法测外泌体蛋白质组。
其中，液相色谱技术与质谱技术联用可对外泌体蛋白质组进行较全面的定性和定量分析。
外泌体在心血管疾病诊疗中的研究进展
外泌体在心血管疾病诊疗中的研究进展刘辉【摘要】外泌体是一种由细胞分泌的细胞外囊泡,具有脂质双分子层结构,内含多种细胞特异的脂质、核酸及蛋白质等,参与细胞间通讯,在多种病理生理过程中起重要作用.近年来,外泌体成为研究的热点,随着研究的深入,外泌体在心血管疾病中的作用受到广泛关注.现就外泌体的结构功能特点以及在心血管病诊疗中的研究情况做一综述.【期刊名称】《心血管病学进展》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】4页(P691-694)【关键词】外泌体;干细胞;心血管病【作者】刘辉【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外医院心血管疾病国家重点实验室,北京 100037【正文语种】中文【中图分类】R54外泌体(exosome)是一种由细胞分泌到细胞外的磷脂双分子层囊泡状小体，内含多种蛋白、脂类、信使核糖核酸/微小核糖核酸(mRNAs/miRNAs)等，参与细胞间通讯、免疫调节以及细胞信号通路调节等过程，从而发挥重要作用[1]。
来源于不同细胞的外泌体其组成成分及功能不同，可作为疾病诊断的生物标志物。
此外，外泌体的脂质双分子层结构，使其成为一种理想的靶向给药载体。
心血管疾病已经成为危害人类健康的头号杀手，发现一种新型的治疗方式迫在眉睫，外泌体在心血管病领域的研究受到广泛关注。
1 外泌体与细胞外囊泡1.1 细胞外囊泡细胞外囊泡是由细胞分泌的膜性颗粒，为一组异质性较大的亚细胞成分，包括胆固醇、鞘磷脂及磷脂酰丝氨酸等在内的多种脂质成分，并富含核酸及蛋白质，几乎所有细胞均可分泌细胞外囊泡[2]。
细胞外囊泡的发现可以追溯到1946年,Chargaff等[3]在31 000 g的条件下离心血浆，发现一种可以加速血栓形成的微粒。
细胞外囊泡第一次被报道是在1967年，Wolf[4]通过透射电子显微镜发现一种由血小板分泌的微粒，当时命名为“platelet dust”。
最初大家认为，细胞外囊泡是细胞用来清除代谢废物的垃圾桶。
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临床检验杂志2016年12月第34卷第12期Chin J Clin LabSci,Dec.2016,V01.34,No.12DOI:10.13602/ki.jcls.2016.12.11外泌体蛋白质组学研究进展宰・927・・综述・覃思华,郑磊(南方医科大学南方医院检验科,广州510515摘要:外泌体(exosome是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡。
可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等。
大多数外泌体有特殊的功能,可能与细胞信号转导功能相关。
现已发现外泌体参与疾病进展、肿瘤血管生成、免疫监视等多个环节。
外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。
该文总结外泌体蛋白质组学的研究思路及方法, 综述目前外泌体蛋白质的临床作用,并对外泌体蛋白质组学研究面临的挑战和前景进行分析与评述。
关键词:外泌体;蛋白质组学;疾病中图分类号:R446文献标志码:A20世纪80年代,Johnstone等¨1发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白,并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(即外泌体。
外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。
而其中蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途径旧J。
与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋白质组学研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发展。
但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。
1外泌体及其结构功能外泌体是细胞进化过程中内出芽形成的多泡体释放的一类直径为30~100am的脂质双层膜的小囊泡,可由各种类型的细胞分泌,也可在各种体液中分离出来,包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。
外泌体携带着大量的细胞特异的生物活性分子,如核酸、蛋白质、脂类和糖类等,这些物质经过亲代细胞选择和特殊包装而进入外泌体,是激发信号转导机制的关键,在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用,如免疫调节[3J、动脉粥样硬化H o、肿瘤药物抵抗垆1、抗病毒㈣等。
外泌体起源于胞内体途径。
细胞内吞的囊泡被分类并到达溶酶体和细胞膜。
瑚J。
早期核内体与细胞内吞的囊泡融合,将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收,成为再生的早期核内体。
这些核内体经历一系列转化后成为晚期核内体。
在此转化过程中,晚期核内体逐渐形成多泡小体(mul-tivesicular bodies,MVBs,而其中30~100nln的囊泡从多泡小体的管腔出芽一J。
多泡小体可以与溶酶体融合,参与溶酶体途径,或参与分泌途径,与质膜融合¨1。
溶酶体途径将导致内容物降解,而分泌途径中形成外泌体释放到细胞外微环境。
以上一系列从核内体复合物到外泌体的形成过程需要内体分选转运蛋白复合物(ESCRT和其他相关蛋白质如 Alix[7]。
外泌体是由胞外分泌产生的,不同的脂质与脂质相关的酶也控制着外泌体的分泌过程¨…。
也有的理论强调胞质蛋白半乳凝集素5(galectin-5参与了核内体和外泌体的释放¨1。
,所以蛋白质对于外泌体的产生和发挥生理功能都有着重要作用¨“。
目前的研究常以外泌体蛋白在细胞中的定位进行分类。
外泌体中细胞质蛋白最丰富,在体液中可达47%,在细胞上清中为43%,其次是膜蛋白(体液和细胞上清中分别为28%和34%,核酸和线粒体蛋白则较低,大部分的膜蛋白和细胞质蛋白在外泌体中较保守,这在不同来源的外泌体中均已被证实¨3|。
另一种分类方法主要将蛋白质分为两大类。
一类是非特异性蛋白质,大部分是来源于亲代细胞中保守区域的细胞质和膜蛋白,如细胞骨架蛋白[肌动蛋白(actins、微管蛋白(tubulins、埃兹蛋白(ezrin、膜突蛋白(moesin],新陈代谢相关的酶[磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH、烯醇化酶1 (enolase 1、磷酸甘油酸激酶1(PGKl、丙酮酸激酶2 (PKM2],核糖体蛋白,跨膜蛋白[多聚免疫球蛋白受体 (PIGR、溶酶体相关膜蛋白1(LAMPl、CD59],膜联蛋白(annexins,热休克蛋白,粘附蛋白[整合素(integrin8、乳腺肪球因子8(MFGE8]等,这些蛋白质可能参与上述的外泌体的合成过程。
另一类则是不同来源外泌体的特异性蛋白质,经质谱研究发现其携带了4400余种特异性蛋白质¨“。
这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用,在不同的生理病理条件下有表达差异,因此更具备生物学标志物的潜力。
体液中的外泌体蛋白质受血液高丰度蛋白质干扰少、表达稳定,使其较血液中传统的可溶性诊断分子更有意义。
外泌体还携带了特异的信息,介导疾病的发生发展,具有作为生物学标志物的潜力。
2外泌体的分离及鉴定2.1外泌体的分离和纯化外泌体蛋白质组学研究的前提是获取均匀的无污染的囊泡蛋白产物,故要排除病毒、杂蛋白和外泌体聚集等影响。
不同提取方法获得外泌体的回收率、纯度和颗粒完整性差异较大,目前仍缺乏统一标准的分离方法¨“。
Lobb等¨刮对蔗糖密度梯度离心法、差速超速离心法、尺寸排阻(size exclusion isolation,SEC法、沉淀法、超木基金项目:国家自然科学基金(81371901;广州市科技计划资助项目(1563000220;广州市健康医疗重大专项(201604020015。
作者简介:覃思华,1991年生,女,技师,硕士,研究方向:细胞外囊泡作为疾病诊断标志物。
通信作者:郑磊,教授,博士,E・mail:nfyyzhenglei@.C11。
万方数据・928・临床检验杂志2016年12月第34卷第12期Chin J Clin LabSci,Dec.2016,V01.34,No.12滤法获得的产物进行了初步的表征分析,提出使用每微克蛋白质的颗粒浓度来衡量分离产物的纯度,结果发现沉淀法的回收产率最高但纯度最低,提示得到的产物中有大量的蛋白质并不属于外泌体;超高速离心可能会造成较大损耗,也损伤囊泡,导致分离效果稳定性差;而血浆外泌体分离SEC法产物纯度可与超速离心法相媲美,甚至高于蔗糖密度梯度离心法。
也有一些研究以外泌体表面标志蛋白质为基础,利用与磁珠或其他固定相以共价键或高亲和作用连接的抗体,再通过低速离心或磁场的物理方法将固相流动相分离,达到免疫亲和分离外泌体的目的¨“。
进行蛋白质组学研究的分离要求远高于核酸分析,因为回收产物中蛋白质污染最难去除,也很难保持产物的同质性,这是外泌体蛋白组学研究受限的最主要的原因¨2|。
Abramowicz等Ⅲ1对差速超速离心法、蔗糖密度梯度离心法或碘克沙醇离心法、化学沉淀法、凝胶过滤法、免疫捕获法获得外泌体进行分析,认为目前阶段适宜开展蛋白质组学的研究方法为差速超速离心法与碘克沙醇或蔗糖密度梯度离心或凝胶过滤相结合,此法为制备超大量外泌体进行大规模质谱分析提供了可行的方案。
2。
2外泌体的鉴定成功分离出均匀无污染的外泌体后要对产物进行鉴定,鉴定一般从以下几个方面进行:定量外泌体浓度和粒径、电镜直接观察其大小形态和鉴定表面蛋白质标志。
纳米颗粒跟踪分析技术常用于定量外泌体浓度和粒径,根据粒子布朗运动轨迹计算外泌体浓度和粒径,易受其他污染蛋白质或与外泌体粒子直径相近的粒子影响¨5|。
电镜对于外泌体的形态学、大小、标志物存在的观察都很有价值,但在浓度测量方面价值有限。
而仅通过外泌体表面的常用蛋白质标志[CD63、CD9、肿瘤易感基因101(TSGl01等]的免疫印迹实验不能判断这些蛋白质是否来自外泌体,也不能判断其是否存在污染¨…。
因此实验中需将几种鉴定方法联合使用。
3外泌体蛋白质组学分析常用的技术有双向凝胶电泳、液相色谱、质谱等。
在外泌体研究中,单一的技术无法满足研究全面需要,故实验室内常将几种技术联合使用。
3.1外泌体蛋白质表达模式研究蛋白质表达模式是研究外泌体内的蛋白质的组成并了解其生物学信息。
通过凝胶电泳或质谱手段,获取不同样本来源外泌体内不同的蛋白质组成,分析其成为生物学标志物的可能性,发现特异的蛋白质成分或表达量的差别从而应用于临床。
Melo等¨引通过超高液相质谱联用发现一种细胞膜锚定蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican.1,GPCI在肿瘤细胞分泌的囊泡中特异性高表达,随后在胰腺癌患者血清外泌体中验证了该蛋白质具有极高的特异性和敏感性,将其与常规标志物CAl99相比,表明其更能预测术后的生存期及肿瘤负荷,还在转基因小鼠模型中通过该蛋白质预测胰腺癌情况,确定其是早期胰腺癌特异性的生物学标志物。
而膜蛋白较胞质蛋白更易检测,从临床方面可以分析其成为生物学标志物的可能性,并进行大规模的临床验证,评价其临床应用价值。
另一方面,通过各种蛋白质组学技术获得蛋白质表达谱及蛋白质相互作用信息进行基因功能深层预测四1,再进行下一步的功能研究或通过预测信息展开更深层次的基因功能的研究。
如Clark 等口¨在2015年分离非小细胞肺癌两种不同细胞系及正常人支气管上皮细胞上清中的外泌体,然后用细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC定量蛋白组学分析筛出3组之间差异蛋白721个,并对其两两比较分析其差异蛋白质的功能分析预测,发现肺癌细胞外泌体蛋白质在细胞侵袭、血管生成及增殖中起作用,还可调节受体细胞的增殖能力,揭示了外泌体蛋白质在肺癌进展过程中有重要作用。
3.2外泌体蛋白质功能模式研究大量的研究主要是对细胞上清中的外泌体蛋白质定性后研究其生物学功能,其中肿瘤来源外泌体蛋白质研究最多。
研究通常从两方面着手,一是某蛋白质的生物学功能及作用已明确,而现发现其发挥作用与外泌体有密不可分的重要关联。
如外泌体分泌的 HSP90a增强细胞运动能力旧J,胰腺及脑部肿瘤外泌体中表皮生长因子受体(EGFR对细胞增殖有影响旧剖,乳腺及结直肠肿瘤细胞来源的外泌体中双调蛋白可影响肿瘤侵袭m。
,EB病毒感染的鼻咽癌来源的外泌体中EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl可激活ERK和P13K/AKT信号通路旧“,这些蛋白质大多通过激活信号转导途径发挥作用,对肿瘤的发生发展有重要作用。
另一方面则从表达谱中筛选出特异蛋白质,并研究其生物学功能及相关信号通路。
通过蛋白质组学研究在几种肿瘤转移模型中整合素的表达模式,发现在肺转移中外泌体整合素面阳和西B1起关键作用,而外泌体中整合素otvB5在肝转移中起关键作用,如果下调整合素面p4和(xv凹,能分别阻止肝、肺转移,表明被特定器官的细胞获取的肿瘤外泌体可为肿瘤的转移准备转移前微环境;外泌体整合素可激活Sre磷酸化以及促炎症反应S100基因表达,可作为预测肿瘤转移的器官倾向性的诊断指标ⅢJ。